首次报道了人类TRPM1在传导状态下的冷冻电镜结构，揭示了其独特的顺时针域交换孔模块拓扑结构，为理解其组成性门控机制及疾病相关功能障碍提供了框架。

研究的主要内容

·Single-Channel activity and constitutive gating of human wild-type TRPM1：为研究TRPM1功能，将野生型TRPM1纯化并重组到脂质双层中进行单通道记录。结果显示，在无激动剂的情况下，TRPM1表现出自发的通道开放事件，其开放概率（Po）约为0.7，电导约为12 pS，这表明它具有组成性通道活性。在添加孕烯醇酮硫酸盐（PS）后，其基础开放概率进一步增加至约0.8，电导增加至约15.5 pS，这与配体依赖性增强而非必需配体依赖性激活的现象相一致。TRPM1的通道活性受到2-APB的抑制，这与密切相关的TRPM3通道对2-APB不敏感的情况形成了区别。与TRPM3不同，TRPM1的PS激活过程不需要PIP?，但PIP?的加入能够增加Po并稳定通道开放状态。单通道记录还揭示了一个此前未报道的中间电导状态（约1 pA；在-140 mV时约6 pS），该状态要么持续存在，要么转变为完全开放状态（约5 pA；在-140 mV时约33 pS），与多步门控机制一致。离子通道的活性表现出显著的电压依赖性，例如TRPV1通道在跨膜电压变化时的响应。在某些通道中，如中性粒细胞膜上的K+通道，观察到在特定电压范围内通道的开放概率会显著增加或减少，这表明了通道活性对电压的敏感性以及门控的不对称性。

·Structure determination of TRPM1：为进行TRPM1的结构研究，利用基于荧光检测的尺寸排阻色谱（FSEC）对小鼠和人类TRPM1直系同源物进行去污剂筛选，以优化通道表达和稳定性。其中人类TRPM1表现出最有利的表达和单分散特性，因此被选作进一步分析对象。为提高冷冻电镜样品的均一性，生成了一个截短的构建体（称为TRPM1-EM），该构建体缺失外显子11、一个柔性聚赖氨酸环和其他无序残基。此构建体相对于野生型TRPM1显示出显著改善的单分散性和稳定性。将TRPM1-EM重组到脂质双层中并通过单通道记录检查，发现其与野生型TRPM1类似，表现出自发开放事件，包括约1 pA的中间电导，然后转变为完全开放状态，且通道活性被激动剂增强。与野生型TRPM1需要强负膜电位激活不同，TRPM1-EM在PS和PIP2存在下在较低的负电压（-20至-40 mV）下开放，表明外显子11和/或聚赖氨酸环有助于TRPM1门控的调节。由于TRPM1-EM比野生型TRPM1更有效地定位于膜，通过Fura-2 AM基于细胞内钙测量显示，TRPM1-EM表现出可靠的激动剂诱发的Ca2?内流，对PregS、克霉唑和伏立康唑有激活作用，EC??分别为23.4 ± 4.3 μM、8.3 ± 0.6 μM和45.3 ± 4.4 μM，而2-APB或辣椒素未引起激活，PregS诱发的Ca2?信号可被2-APB有效抑制（EC??≈40 μM）。在对纯化的TRPM1-EM进行单颗粒冷冻电镜分析时，我们观察到初始2D类平均图像呈现出四重对称的四聚体结构，这与TRPM亚家族成员的细胞内二级结构特征相一致。通过冷冻电镜技术，我们得到了整体分辨率为4.36 ?的三维重建模型，其中细胞内MHR结构域和C端卷曲螺旋区域的局部分辨率更高。尽管如此，N端的80个残基、C端的211个残基以及特定细胞内环（残基605-635、809-853、1156-1180）在最终模型中未能解析，这可能是由于这些区域的构象灵活性所致。冷冻电镜技术在膜蛋白结构解析中的应用，特别是在高分辨率下的能力，为理解TRPM1-EM的结构提供了重要信息。

·Overall structure of TRPM1：TRPM1-EM的冷冻电镜密度图显示其在TRPM家族中具有广泛保守的结构，细胞内结构域与TRPM3非常相似，但跨膜区域相对于其他六跨膜（6-TM）四聚体离子通道表现出不同的非规范组织。从N端开始，蛋白质包含保守的黑素瘤同源区域MHR1/2和MHR3/4，MHR1/2结构域形成由重复的β-α-β基序组成的蛤壳状Rossmann样折叠，而MHR3/4结构域主要是螺旋状，由介导广泛亚基间接触的螺旋－转角－螺旋元件组成。与TRPM3一样，这些细胞内结构域组装成一个大的胞质平台，支持跨膜区域，这种细胞内结构对于四聚体组装至关重要，并介导变构调节通道门控的蛋白质-蛋白质相互作用，包括与G蛋白的相互作用。在MHR结构域之后，如同TRPM3和其他TRPM通道一样，每个TRPM1亚基贡献六个跨膜螺旋（S1-S6），其中螺旋S1-S4形成电压传感器样结构域（VSLD），螺旋S5-P-S6组装成中央离子传导孔。细胞内C端以保守的TRP螺旋开始，随后是TRP后肘、肋螺旋和介导四极化的中央卷曲螺旋结构域。

·Structural discovery of a new transmembrane architecture in tetrameric ion channels：四聚体离子通道被认为是从简单的双跨膜孔模块进化为典型的六跨膜（6-TM）结构，其中S1-S4电压传感器或电压传感器样结构域与S5-P-S6孔模块功能耦合。在包括电压门控钠、钙和钾通道在内的结构表征的6-TM通道中，当从细胞外侧观察时，孔结构域相对于S1-S4采用逆时针方向，通常导致定型的域交换或非交换拓扑结构。TRPM1-EM的冷冻电镜结构颠覆了这一普遍范式，其细胞内组装符合TRPM家族并与TRPM3非常相似，但跨膜区域采用根本不同的组织方式。每个TRPM1亚基保留典型的6-TM折叠，但其四聚体排列非常规：S5-P-S6孔模块相对于S1-S4结构域顺时针旋转，产生与先前表征的6-TM四聚体通道相反的拓扑结构。这种反向取向定义了以前未被识别的跨膜折叠，并表明替代域组织可以支持离子传导。TRPM1和TRPM3的S1-S4结构域的结构叠加显示这种差异起源于S4-S5连接处，超过此点，TRPM1孔螺旋相对于TRPM3经历实质性的平移和旋转重排：S5位移约51 ?，S6位移约56 ?，孔螺旋位移约21 ?，这些位移对应于孔模块约53°的整体顺时针旋转，S5和S6相对于S1-S4结构域旋转约50°。孔模块的这种重组不是刚体运动，而是孔结构域表现出内部重塑，包括S6相对于S5的明显重新定位，改变了传导途径内的螺旋堆积，由此产生的结构由不同的疏水相互作用网络稳定，与TRPM3不同，突出了孔稳定的不同结构策略。

·Ion conduction pathway in the TRPM1 pore：为确定TRPM1结构中捕获的功能状态，计算了选择性过滤器和细胞内门处的孔轮廓和半径。选择性过滤器由G1056和带负电荷的E1052形成，与TRPM3中观察到的保守结构相似，但TRPM1的选择性过滤器采用明显更宽的构象，最小直径半径约为8.35 ?，而TRPM3的闭合状态约为3.65 ?，显示TRPM1-EM开放状态下的大横向窗孔。此前在PS结合的TRPM3中观察到类似加宽的选择性过滤器，其中孔螺旋附近的配体结合稳定开放的选择性过滤器构象。与PS和CIM0216结合的TRPM3一样，在TRPM1孔中可以看到由脂质排列的大横向窗孔。与此机制一致，在TRPM1孔螺旋附近观察到额外的密度，表明脂质介导的开放选择性过滤器的稳定。在选择性过滤器正下方，TRPM1包含一个由非极性残基排列的扩展疏水腔，比TRPM3的大得多，可能在渗透过程中容纳水合阳离子。细胞内激活门位于S6束交叉处，最窄的收缩由N1116和I1111形成，在TRPM1结构中，该门完全开放。相对的N1116侧链之间测量的直径约为8.5 ?。扩展的选择性过滤器与完全开放的门共同支持TRPM1以组成性传导状态被捕获的结论。

·Gating mechanism of TRPM1：TRPM1的门控结构与其孔结构域相对于电压传感器样结构域的独特顺时针旋转密切相关，这导致S5-P-S6螺旋的独特空间排列。与TRPM3相比，这种重排形成了扩展的选择性过滤器与加宽的细胞内门，共同使通道偏向传导构象。TRPM1的选择性过滤器由G1051和E1052形成，采用相对开放的几何结构，与部分或完全水合阳离子的渗透一致，而TRPM3中较窄的过滤器有利于离子渗透过程中的脱水。在TRPM3静息闭合状态下，孔螺旋的C末端定位在膜内更深（距细胞外侧约20 ?），并朝向中央疏水腔，在那里它有助于稳定渗透离子。相比之下，在TRPM1中，孔螺旋的C末端更靠近细胞外小叶（膜内约11 ?），并采用更平行于膜的方向，而不是朝向腔突出。这种改变的几何结构伴随着扩大的疏水腔，可能为稳定水合或部分水合离子提供额外空间。值得注意的是，在TRPM3的孕烯醇酮硫酸盐结合状态中观察到类似的孔螺旋重排和选择性过滤器扩张，其中通道激活与选择性过滤器扩张增加相关。在细胞内束交叉处，S6螺旋显著发散，形成由N1116和I1111排列的完全开放的门，具有与激活构象一致的宽收缩。S6表现出明显的向外弯曲并远离离子传导轴，进一步促进门的开放。值得注意的是，S6和TRP结构域之间的连接采用环状构型而非连续螺旋，这在其他TRPM通道开放期间未观察到。S6-TRP螺旋接头在TRPM7和TRPM8的不同门控状态中采用不同的构象，表明该区域在定义TRPM家族通道的门控行为中起重要作用。基于S1-S4支架（PDB: 8DDQ）的TRPM1与TRPM3的结构比对显示细胞质MHR1/2和MHR3/4结构域的相对位置存在显著差异，表明细胞内调节元件与跨膜门之间存在耦合。更具体地说，这些比较表明，相对于TRPM3的闭合状态结构，TRPM1中的MHR1/2结构域向上旋转，而MHR3/4结构域向跨膜区域扭曲。这些构象重排先前与其他TRPM家族成员的通道激活相关。与激活状态一致，来自MHR3/4的α21-α22基序的D702和D703与相邻亚基的S1前肘的Y727和T766结合，这种相互作用是TRPM4、TRPM7和TRPM8开放状态结构的特征。这些细胞质重排与TRPM1中观察到的扩展离子传导途径相关，支持该结构捕获传导构象的结论。此外，在S4-S5肘、TRP结构域和S1前区域之间的界面发生实质性重塑，其中残基W776、Y994和W1129采用改变的构象，标志着S4-S5接头顺时针交换的支点。孔结构域的顺时针旋转、选择性过滤器的扩张和S6门的张开共同定义了TRPM1本质上偏向传导的门控结构，这种结构配置为TRPM1的组成性活性提供了机械基础，并将其与依赖逆时针孔旋转激活的其他TRPM通道区分开来。

总体结论

·关键发现：本研究首次解析了人类TRPM1在传导状态下的冷冻电镜结构，揭示了其独特的顺时针域交换孔模块拓扑结构，这一发现不仅为TRPM家族离子通道的结构研究提供了新的视角，而且与之前表征的6-TM四聚体离子通道的逆时针孔取向形成鲜明对比。单通道记录显示TRPM1具有组成性活性，其开放概率约为0.7，电导约12 pS，PS可将其开放概率增加到约0.8，电导增加到约15.5 pS，且存在中间电导状态和电压依赖性门控。结构分析揭示TRPM1的选择性过滤器扩张（最小半径约8.35 ?）、中央腔扩大以及S6螺旋张开形成宽的细胞内门（直径约8.5 ?），这些特征与其组成性传导状态一致。

·研究领域重要性：这些发现不仅揭示了一种新的6-TM四聚体通道折叠方式，扩展了对离子通道结构多样性的认识，而且为理解TRPM1的组成性门控机制提供了结构基础。TRPM1在视网膜ON双极细胞信号传导和夜视中至关重要，其功能障碍与先天性夜盲症相关，该结构为研究TRPM1相关疾病的发病机制提供了分子框架，也为基于结构的治疗策略开发奠定了基础，有助于针对TRPM1相关视觉和色素障碍的药物研发。

图1. TRPM1通道的功能表征：基于Fura-2钙成像与单通道电生理记录的综合分析  

（A）野生型TRPM1在HEK293F细胞中表达后，经激动剂刺激所引发的细胞内Ca2?浓度变化（采用Fura-2 AM荧光探针检测）；插图显示Western blot验证结果：Strep标签化全长TRPM1成功表达，S（上清液）与P（沉淀）分别代表经指定非离子型去污剂处理后的可溶性与不溶性组分。  

（B）经冷冻电镜结构解析优化的TRPM1构建体（TRPM1-EM）在同等条件下表现出相似但可区分的Ca2?响应动力学。  

所有钙成像数据均以均值±标准误（SEM，n = 3）表示；组间差异采用配对双尾Student’s t检验进行统计学评估（*P < 0.05，**P < 0.01）。  

（C）剂量–效应关系分析表明，孕烯醇酮硫酸盐（Pregnenolone sulfate, PregS）对TRPM1-EM具有浓度依赖性激活作用，其半数有效浓度（EC??）为23.4 ± 4.4 μM（拟合自三参数Logistic模型）。  

（D–G）在含生理浓度磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP?）及10 μM PregS的缓冲体系中，将纯化的野生型TRPM1（D、E）与TRPM1-EM（F、G）分别重建至平面脂质双层膜，开展单通道电生理记录。D与F分别为二者典型的单通道电流轨迹；E与G为其对应幅度分布直方图（bin width = 0.1 pA），揭示两种构建体在门控动力学（如开放概率、平均开放时间及电导特性）方面存在系统性差异。