拉曼光谱仪应用医疗篇——使用基于SERS的方法筛选和多重检测癌症外泌体

外泌体是携带细胞重要信息的小囊泡。它们与细胞间通讯和肿瘤微环境的调节有关。先前的研究表明，外泌体是一种重要的癌症生物标志物，外泌体的检测在癌症诊断中至关重要。表面增强拉曼散射（SERS）是一种独特的生物分子检测方法。SERS光谱能够提供高灵敏度、高稳定性的指纹信息。

制备了第一层硅壳(MB@SiO2)和第二层金(MB@SiO2@Au)包覆的磁珠(MB)作为捕获底物，其表面用通用表面蛋白CD63适配体修饰。制备了带有特定适配体修饰的金纳米颗粒(AuNP@aptamer)作为读出信号源。为实现多重检测，使用三种不同类型的拉曼报告子和适体合成了三种SERS探针。当将一种靶外泌体加入到捕获底物和SERS探针的混合物中时，只有特异性的SERS探针才能识别靶外泌体，并与磁性底物形成三明治型aptas -免疫复合物。在配合物被磁铁沉淀后，检测上清液的SERS信号。添加外泌体对应的SERS探针的信号强度变弱，而其他非特异性SERS探针的信号保持不变。因此，SERS强度的降低表明该方法中目标外泌体的存在。

1、SERS探针的表征和捕获底物

图2  (a) MB, (b) MB@SiO2, (c) MB@SiO2@Au的TEM图像。(d) probeSKBR3和DNTB在1326 cm?1的优势波段的SERS谱图。(e) probeLNCaP和2NAT的优势波段在1378 cm?1处的SERS谱图。(f) probeT84的SERS谱和MMC在1170 cm?1处的优势波段。

2、分别检测三种外泌体

三种外泌体检测限(LOD)不同。SKBR3外泌体的LOD约为每微升32个外泌体/微升；T84外泌体的LOD为73外泌体/微升；而LNCaP外泌体的LOD为203外泌体/微升。

图3  (a)添加不同浓度SKBR3、(c) LNCaP、(e) T84外泌体后的上清SERS谱。浓度以“每μL外泌体”表示。(b) (a)中1326 cm?1波段光谱强度变化。(d) (c)中1378 cm?1波段光谱强度变化。(f) (e)中1170 cm?1波段光谱强度变化。图中为目标外泌体浓度与相应波段强度变化相关性的非线性拟合函数。

3、使用SERS探针筛选外泌体

如图4所示，当探针混合在一起时，SERS探针仍然可以识别目标外泌体。表明可以同时检测到大量不同种类的外泌体;这表明基于SERS-based的方法很有希望用于癌症筛查。

图4   将(a) SKBR3, (c) LNCaP, (e)不同浓度的T84外泌体添加到捕获底物和三种SERS探针的混合物中，上清液的SERS光谱。1326、1378和1170 cm?1波段强度值变化的校准曲线分别如图(b)、(d)和(f)所示。

4、同时检测多个外泌体

与对照探针的SERS强度相比(图5h)，在探针和底物的混合物中加入一种外泌体会使相应探针的强度降低(图5a-c)。此外，两种外泌体的加入导致了两种对应探针强度的降低(图5d-f)。此外，当三种外泌体同时加入时，三种探针的SERS强度均下降(图5)。从光谱上，我们可以很容易地区分添加外泌体的类型。因此，实验结果表明，SERS强度的降低可以提示相应类型外泌体的存在。

图 5将(a) LNCaP, (b) T84, (c) SKBR3, (d) SKBR3和T84， (e) SKBR3和LNCaP， (f) LNCaP和T84， (g) SKBR3、LNCaP和T84外泌体加入到捕获底物和SERS探针的混合物中，得到上清液的SERS光谱。(h)捕获底物的上清和空白对照的SERS探针的SERS谱。

5、真实血液样本中外泌体的检测

评估基于SERS-based的方法在真实血液样本中检测外泌体。我们获得了三名患有乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的患者的血液样本。从一个正常人身上获得的血液作为对照。正常人血液的SERS谱在1326、1378和1170 cm?1三个主要波段中强度最强;这表明从正常人身上获得的血液中不含有三种类型的癌细胞来源的外泌体。然而，乳房患者血液的SERS谱癌症表现出较弱的probeH2信号强度;这表明存在乳腺癌外泌体。同样，结直肠癌患者血液的SERS谱也显示probeT84强度减弱，前列腺癌患者血液的probeLNCaPSERS强度较弱;这表明存在相应种类的外泌体。实验结果证明，这种基于SERS-based方法在癌症筛查中可能具有潜在的应用前景。

图6  将不同癌症患者的血液样本加入到捕获底物和SERS探针的混合物中后的上清的SERS光谱。

研究提出了一种基于SERS-based的同时检测不同类型外泌体的方法。在单种外泌体的检测中，SKBR3、T84和LNCaP外泌体的LOD值分别为32、73和203 /微升。该方法可用于一步区分目标外泌体的种类，模拟癌症筛查。更重要的是，从患有乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的患者身上获得的真实血液样本被用来研究这种方法的实际应用。的MR系列显微拉曼应用于SERS在癌症早期筛查中具有广阔的应用前景。