【热点应用】多角度动态光散射(MADLS)技术在LNP物理表征中的应用

本文由粒度资深应用专家黎小宇供稿

LNPs（Lipid Nanoparticles，脂质纳米颗粒）因在COVID-19 mRNA疫苗中成功发挥作用，有效地保护和运输mRNA到细胞而闻名。然而，我们需要彻底理解这些系统的生物物理特性，以确保它们的安全性、稳定性和有效性，并确保监管部门的批准。动态光散射(DLS)是一种公认的工具，可以通过提供粒径和聚集形成的信息来帮助LNPs的生物物理表征。多角度动态光散射(MADLS)则更进了一步：传统的单角度背向散射只能提供粒径信息，而多角度检测可以产生更高分辨率的粒径分布(PSD)和颗粒浓度数据。

什么是脂质纳米颗粒?

LNP通常呈球形，由脂质核心基质组成，脂质核心基质本身通常由可电离的离子脂质、聚乙二醇化脂质和胆固醇组成 (图1)。这些都有助于在不同的生物环境中稳定和保护LNP——这一点很重要，因为作为药物递送载体，LNP可以运输疏水或亲水分子，包括小分子、蛋白质和核酸^[2]。当然，我们了解它们物理特性的能力对于获得监管机构的批准至关重要。

图1 本研究表征的mRNA-LNP的基本结构和组成示意图

LNP的两个重要物理属性是粒径分布(PSD)和多分散性。DLS测量颗粒在单角度(通常为背散射或侧散射角)进行布朗运动时散射强度的波动，通过使用累积量或非负最小二乘法(NNLS)分析波动，DLS数据提供了样本内平均直径(Z-average)、多分散性指数(PdI)或PSD的信息。观察平均粒径(Z-average)和多分散性指数(PdI)的变化是监测LNP制剂稳定性的常用方法。

MADLS是一种比单角度DLS更高级的选择，它使用三个不同的检测角度（前向、侧向和背向）进行PSD测量，该测量考虑了角度相关的散射信息，因此可以在包含多种尺寸种群的样品中获得更高分辨率的粒度分布(PSD)图像。此外，MADLS允许我们计算样品中每个种群的总颗粒浓度^[3]。

本研究使用了两种mRNA-LNP配方: LNP1和LNP2。动态光散射(DLS)和多角度动态光散射(MADLS)的测量使用Zetasizer Ultra纳米粒度及电位分析仪，使用波长为632.8 nm的He-Ne气体激光器，最大功率为10 mW。单角度DLS数据来自MADLS测量，因为它是测量的三个角度之一，并且您可以查看测量中的所有角度数据。单角度DLS数据 (NIBS，图2，蓝色) ，并与MADLS测量中所有三个角度的组合结果 (图2，红色) 一起绘制。使用背向散射检测和小体积石英样品池 (ZEN2112 Malvern Panalytical)，对每个样品进行了5次重复测量。由于系统集成了ZS XPLORER软件，仪器设置可以自动优化。

图2 使用Zetasizer Ultra通过NIBS（蓝色）和MADLS（红色）测量的mRNA LNP制剂（LNP 1，A；LNP 2，B）的强度加权PSD。

对于LNP 1，使用DLS获得的PSD显示了样品内的两个粒子群 (图2 A)。相比之下，与传统NIBS相比，MADLS具有更高的PSD尺寸分辨率，可以识别出PSD中的三个不同峰。此外，对于LNP 2, DLS显示了一个由宽峰代表的单一种群，而MADLS则识别了一个较大聚集体的小种群 (图2 B)。已知这些较大的聚集体会使得背散射DLS数据变宽。

与此同时，多分散系数PDI值可以与平均粒径结合使用来描述聚合体或团聚体的存在。查看PdI和%Pd可以揭示LNP1和LNP2在多分散性上的差异。在这种情况下，被认为是单分散体系的指标是%Pd小于20%，PdI为± 0.1³。

表1通过DLS测定mRNA LNP制剂的多分散性

在本次测试中，我们可以看到LNP1是一个比LNP2更分散的样本 (表1)。从MADLS数据中可以明显看出PSD差异 （图2；红色），让我们清楚地了解样本中多个种群的存在，并显示较大聚集体的峰值。

这是一个很好的例子，说明MADLS和DLS如何作为预筛选指标发挥重要作用，以确定样本内聚集体的PSD。MADLS还允许我们测量~10⁹和~10¹²个颗粒/mL之间的颗粒浓度-这扩展了其他技术的浓度范围，如纳米颗粒跟踪分析(NTA^[4])³ -并且可以在广泛的浓度范围内提供颗粒浓度的正交测量。考虑到DLS和MADLS通常用于快速测定粒度、多分散性和/或浓度，该功能对于LNP的开发很重要，因为它可以帮助评估配方或处理步骤对样品稳定性的影响。

评估物理特性，如粒径分布和颗粒浓度，是有效开发LNP作为药物递送载体的关键。从这项研究中，我们可以看到DLS和MADLS等技术的价值，它们可以深入了解样本的潜在不稳定性，例如，随着时间的推移，聚集形成的情况 (参见表2，对可测量属性和相关参数的概述)。

表2 DLS和MADLS测量的样本属性，以及相应的测量参数和所需的样本信息

这两种方法也经常用于了解从一个批次到另一个批次的一致性。DLS和MADLS都可以覆盖很宽的粒径范围 (~1 nm到10 μm)，这使它们比其他技术具有优势。一方面，DLS更适合于多分散性相对较低的样品，其中可能存在另一种较大的颗粒。与此同时，MADLS使用多角度检测来提供更高的PSD分辨率，从而提供有关样本内潜在种群的更多信息。

虽然MADLS也可以作为一种筛选工具，用于检测样本中存在的较大聚集体的小种群 (见图2B)，但它不能分辨大小差异小于2:1 (DLS为3:1)的小群体。然而，它可以用作其他颗粒浓度测量技术的正交验证 (例如，纳米颗粒跟踪分析(NTA)，酶联免疫吸附测定 (ELISA)等)。

参考文献：

[1] Markova, N.; Cairns, S.; Jankevics-Jones, H.; Kaszuba, M.; Caputo, F.; Parot, J., Biophysical Characterization of Viral and Lipid-Based Vectors for Vaccines and Therapeutics with Light Scattering and Calorimetric Techniques. Vaccines (Basel) 2021, 10 (1).

[2] Tenchov, R.; Bird, R.; Curtze, A. E.; Zhou, Q., Lipid Nanoparticles─From Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape of Research Diversity and Advancement. ACS Nano 2021, 15 (11), 16982-17015.

[3] Austin, J.; Minelli, C.; Hamilton, D.; Wywijas, M.; Jones, H. J., Nanoparticle number concentration measurements by multi-angle dynamic light scattering. Journal of Nanoparticle Research 2020, 22 (5), 108.

 [4] N. Markova, et al. Vaccines 10, 49 (2022).

【LNP/AAV】药物载体的生物物理表征方法