SCIEX Echo MS+声波激发质谱快速发现新型氧化脂质FAHFA

研究背景

SCIEX Echo? MS+即声波激发耦合质谱系统，是一个高通量、基于电喷雾电离质谱的系统（图1）。是由声波液滴喷射技术 (Acoustic droplet ejection technology, ADE)，开放端口探针采样接口 (Open-port probe sampling interface，OPI) 以及强大定量能力的SCIEX Triple Quad? 6500+系统三位一体耦合在一起的开创性新质谱产品。该系统能够确保进样过程无残留的同时，可做到每秒分析1个样品中的多个化合物分析。

FAHFA是一类生物活性脂质，是由脂肪酸和羟基支链脂肪酸组成，其结构如图2所示。研究表明FAHFA具备广泛的生物学功能，但在生物体中含量极低，且分子结构变化复杂，所以发现和定量FAHFA仍然具有很大挑战。而羧酸化合物通常在负离子模式下进行检测，色谱流动的弱酸性也会抑制羧酸化合物在ESI源内的电离，制约了质谱的灵敏度，进一步了增加了检测的难度。

图2. FAHFA的分子结构

近年来，武汉纺织大学冯钰锜教授课题组开发了化学衍生的方法，如图3所示，将叔胺基团衍生至FAHFA结构上，可以将负离子模式下检测的脂肪酸转变为正离子模式检测。其衍生化后的产物，可产生强度高并且稳定的碎片离子，提高了其检测灵敏度和准确度。但是由于生物体内FAHFA种类较多，传统的LC/MS方法去发现新的FAHFA通量较低，所以急需开发一种高通量的检测方法。

图3. FAHFA化学衍生反应

冯钰锜教授课题组近期开发了化学衍生辅助SCIEX Echo? MS+系统检测的分析方法，高通量高灵敏度的筛查了真菌中的FAHFA，检测流程如图4所示。利用SCIEX Echo? MS+系统的超快分析速度（每秒1个样品）和N, N-二甲基乙二胺（DMED）衍生化的灵敏度增强，该方法能够在不到2小时内筛选超过2800个潜在的FAHFA分子，比传统的LC-MRM MS筛选方法快一个数量级以上。此外，该课题组还首次在食用真菌中发现了新的氧化FAHFA分子，表明可能涉及氧化修饰或氧化修饰的生物合成。

图4. 化学衍生辅助Echo Mass检测的分析方法流程

研究结果

作者使用建立好的方法，结合化学衍生，分析了14种真菌中的FAHFA。通过使用标准品对比检测灵敏度，化学衍生后其检测灵敏度提高了约20倍，LOD可达0.2ug/L。由于Echo Mass OPI流速的稀释效应，大大减小了样本基质效应，常规方法需要使用SPE方式进行样本纯化降低基质效应，而使用当前SCIEX Echo? MS+系统进样方法，无需使用SPE前处理方式，化学衍生后可直接进样分析，因此方法在降低了基质效应的同时并不会影响检测灵敏度，连续进样时，使用不同溶剂溶解样本的稳定性也是优秀的（如图5所示）。

图5. 样本前处理方式影响及检测重复性

作者将整个分析工作流程用于食用真菌中FAHFA的筛查，从样品提取到化学标记，SCIEX Echo? MS+系统分析和数据处理，由于该方法不需要传统的液相分离且结合SCIEX Echo? MS+系统极快的进样速度，整个分析流程只需要大约需要2小时，时间上，至少比传统的化学衍生液质联用（CL-LC-MRM MS）的方法快一个数量级。筛查结果上来看，总共可以检测并且定性出219类FAHFA物质（图6a）。为了验证结果的准确性，作者将同样的样本也用传统的液质联用的方法进行了验证，结果显示SCIEX Echo? MS+方法鉴定了24个中长链FAHFA家族，而CL-LC-MRM MS方法检测了23个家族（图6b）。值得注意的是，两种方法均检测到其中19个FAHFA家族，表明SCIEX Echo? MS+方法在初步筛查中达到了约83%的覆盖率，优于LC-MRM MS方法。

图6. 使用化学衍生结合Echo Mass方法刷查到食用菌内的FAHFA类物质 (a)；

化学衍生结合Echo Mass方法与化学衍生液质联用(CL-LC-MRM MS)的方法检测到FAHFA家族的比较 (b)

最后，作者进一步的分析检测到的FAHFA，结合轻重化学标记，并经过高分辨质谱验证，首次在食用真菌中发现了新的氧化FAHFA分子（图7所示）。

图7. 通过SCIEX Echo? MS+系统筛查出化合物进一步高分辨质谱验证为新的氧化FAHFA物质