Nature文章 | SCIEX Echo MS+高通量数据采集平台助力共价结合药物研发

近年来，通过偶然发现或通过合理设计而获得的靶向共价抑制剂的出现，在传染病药物治疗方面发挥了重要作用，并显著改善了人类健康状况以及制药行业。共价抑制剂通常与酶活性位点中的蛋白质亲核侧链发生不可逆或可逆的反应，从而发挥治疗作用。

聚酮合酶13 (Pks13) 是结核分枝杆菌  (Mtb) 合成霉菌酸的关键酶，霉菌酸是细菌细胞壁的重要成分，对细菌的生存和致病性至关重要。抑制Pks13可阻断霉菌酸合成，导致细菌死亡，因此成为抗结核药物开发的重要靶点。研究人员通过筛选含有SuFEx (Sulfur fluoride exchange, 硫氟交换) 基团的化合物库，经过结构优化，最终得到了CMX410。其结构中含有芳基氟硫酸酯基团，可特异性靶向Pks13的酰基转移酶结构域 (AT) 上的丝氨酸残基形成共价键，最终导致在酶的活性位点内形成一个β-内酰胺环结构，使Pks13不可逆失活。拟议反应机制见图1。

图1. 硫氟交换反应（SuFEx）与活性位点丝氨酸的拟议反应机制

该研究中基于质谱的酶抑制动力学数据采集是在SCIEX Echo MS+搭载ZenoTOF 7600平台完成的。将Pks13-AT结构域蛋白 (溶解于10 mM pH 7.5的TRIS缓冲液) 与CMX410在室温下混合后，进行时间梯度反应，通过SCIEX Echo MS+平台同时监测Pks13-AT蛋白原型、CMX410-蛋白共价结合物和β-内酰胺产物等3种化合物质谱峰面积随时间变化的情况。各时间点的目标物质谱峰经积分后，以未处理对照组 (图2虚线表示) 的Pks13-AT总量为基准进行归一化。质谱数据显示，抑制剂与Pks13-AT以1:1摩尔比例混合后，1分钟内反应完成度即超过50%，表明共价加合物的快速形成及后续β-内酰胺产物的高效生成。具体实验结果见图2。

酶抑制动力学实验是研究抑制剂对酶催化作用影响的核心方法，广泛应用于药物研发和酶工程优化等领域。

此外，研究中的抑制剂稳定性考察同样在SCIEX Echo MS+平台上完成。将1 mM的N-乙酰-L-赖氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸及N-乙酰-L-半胱氨酸分别与抑制剂混合，溶剂为10 mM pH 7.5的TRIS缓冲液或50 mM pH 10.2的碳酸氢钠缓冲液，室温下反应至抑制剂终浓度为100 μM。使用SCIEX Echo MS+搭载ZenoTOF 7600 平台的高分辨率多反应监测(MRMHR) 模式测定峰面积。在该平台上，既可以用高分辨质谱优异的一级质谱母离子进行定性、定量分析，也可以用高分辨率的MRM方式结合Zeno? Trap的二级离子富集能力，进行高灵敏度的二级质谱定量分析，可获得方法专属性更高的实验结果。