食安无忧 | 荧光测定法研究酶动力学

米氏模型

一个简单的酶促反应可以描述如下:

其中E是酶，S是底物，ES是酶-底物复合物，P是生成产物。

当底物浓度远高于酶浓度([S]>>[E])时，在稳态假设下(ES的生成速率等于其分解速率)

酶促反应可以用米氏方程来描述，该方程将反应速度v与底物浓度[S]联系起来，表达式为(等式1)：^1,2

试剂和方法

磷酸氢二钾、磷酸二氢钠二水合物、3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)、辣根过氧化物酶(HRP)、30%过氧化氢(H₂O₂)溶液、氢氧化钠(NaOH)和乙醇(EtOH)均购自默克公司。

将HPPA储备液(2.5 g/L)稀释在磷酸盐缓冲液中，制备不同的底物溶液(覆盖范围为0.05~0.5 g/L，最终体积为1780 μL)，以实现荧光酶测定法。对于每种荧光测定动力学，底物溶液都是直接在标准的10毫米荧光比色皿中配制的，并等待5分钟以稳定溶液温度，然后再继续添加(温度由浸入溶液中的外部探针确认)。然后通过添加50 μL HRP酶(80 μg/L)和170 μL H₂O₂(0.24%)来启动酶促反应，最终体积为2 mL。在最后一次添加H₂O₂后，采用Spectrum FL软件中的动力学方法开始荧光动力学数据采集，参数如表1所示。

表1.用于采集HPPA酶动力学的FL 6500荧光参数

如图1所示，将Peltier控制器连接到FL 6500荧光光谱仪以研究温度对HRP酶参数的影响。温度可以在Peltier控制器上手动设置。

图1.FL 6500荧光分光光度计连接到Peltier控制器以采集酶动力学数据

结果

图2显示了在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H₂O₂的条件下，在15°C时使用荧光底物HPPA研究HRP酶活性所获得的结果。每次荧光动力学数据采集时间为30分钟。该图显示了在所有底物浓度的动力学采集结束时在Spectrum FL软件中所示的数据。左图为相应浓度(0.05 g/L-0.5 g/L)的样品列表，以及软件根据计算时间得到的初始速度。通过改变起始值和结束值，可以轻松修改计算时间。

在本研究中，由于观察到线性关系在前5分钟内有效，因此计算时间设定为0至5分钟。图2中间部分为所选荧光动力学情况([S]=0.3 g/L)，右侧部分为反应速度随HPPA浓度变化的米氏图。在米氏图下方，报告了酶参数V_max=1148 au/min和K_m=0.08 g/L。如米氏图(图2右)所示，在低底物浓度下，反应速度随底物浓度线性增加。这是因为在低[HPPA]时，可供结合的HRP活性位点数量很高，并且每个底物分子都有很高的概率找到酶。随着HPPA浓度的增加，反应速度达到稳定状态。此时，底物分子使所有HRP活性位点饱和，几乎所有可用的酶分子均与底物结合。底物浓度的进一步增加对反应速度几乎没有影响，因为所有HRP分子都已经以最大通量参与催化反应。反应速度主要受空余酶分子的可用性的限制。

图2.15℃时磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H₂O₂的条件下HRP对HPPA的酶活性。在荧光动力学数据采集结束时，结果显示在Spectrum FL软件中。包含计算时间和绘图模型的样品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的选定荧光动力学情况(中)以及包含所得V_max和K_m的米氏图(右)

为了更直观地了解酶参数，通常使用Lineweaver-Burk图(图3，右图)。

图3.15℃时磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H₂O₂的条件下HRP对HPPA的酶活性。在荧光动力学数据采集结束时，结果显示在Spectrum FL软件中。包含计算时间和绘图模型的样品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的选定荧光动力学情况(中)以及包含所得V_max和K_m的Lineweaver-Burk图(右)

它是从米氏方程推导出的双倒数图，其中反应速度的倒数与底物浓度的倒数绘制如下：

它是米氏方程的线性形式，其中Y轴的截距对应于：

X轴的截距对应于：

在Spectrum FL软件中，可以在可用模型的下拉列表中轻松选择模型：Michaelis-Menten、Lineweaver-Burk、Hofstee、Eadie-Hofstee(图3左上)。

温度效应

使用连接到FL 6500荧光光谱仪的Peltier控制器研究温度对HRP酶活性的影响。Peltier控制器允许在采集荧光动力学数据的同时为Peltier比色皿支架设置特定温度。图4显示了在15°C、37°C和45°C下得到的米氏图的比较。表2为所得的V_max和K_m。当温度从15°C升高到37°C时，V_max从1148 au/min增加到1337 au/min，K_m从0.08 g/L增加到0.09 g/L，但酶参数并未受到温度从37°C升高到45°C的影响。这可以解释为，随着温度的升高，HRP接近变性温度50-60°C，由此产生的构象变化可以修饰活性位点，进而改变其酶活性。

表2. 温度对酶参数V_max和K_m的影响

图4.存在H₂O₂时，在15℃(粉色)、37℃(蓝色)和45℃(黄色)获得HRP对HPPA的酶活性的米氏图