干货丨PCR替代方案：RPA重组酶聚合酶扩增技术常见问题解答（FAQ）

下面，小翌就带领大家一起盘点一下RPA常见实验技术问题。

建议使用电泳法进行引物初筛，随后根据靶标序列设计探针，使用荧光型试剂盒，可以读荧光数值，进行量化，并且可以同时做多个条件，更适合探索优化实验条件，筛选引物和探针。此外，试纸型试剂盒，和荧光型设计原理高度相似，在荧光型的引物探针基础上，比较容易得到好用的引物组和探针。

不适用。Taqman探针依赖Taq DNA聚合酶的5’到3’外切酶活性实现荧光信号释放，而RPA体系中所用Bsu DNA聚合酶不具备该活性。

由于反应体系中含有较多的蛋白酶及大分子物质，会导致堵孔，上样前需进行产物纯化。

• 污染风险：高拷贝（≥10^6 copies/μL）的模板，容易造成气溶胶污染；

• 实验分区：样本制备区/试剂准备区/加样区/反应区等尽可能做到分区；

• 环境清洁：每次试验前后或者步骤之间对空气和工作区以及移液器，要用核酸清除剂或10%漂白剂消毒清除气溶胶污染；

• 减少产物开盖次数。

RPA反应在室温下即可启动，若提前加入激活剂（如醋酸镁），极易引发非特异性扩增或底物提前消耗。因此，建议模板与激活剂最后加入，以控制反应起始时机，提高特异性与重复性。

推荐使用FAM通道（羧基荧光素）进行检测，吸收波长为492 nm，发射波长为518 nm。

（1）（PCR）Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶，可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性，可结合温度循环变换过程，在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性，防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增，只有在温度升高后，解除抑制，才释放酶活性，从而进入PCR循环扩增过程。

（2）（LAMP）Bst DNA聚合酶

不同于PCR反应需要反复的热变性以解开DNA双链，在应用上依赖于高质量的热循环仪。自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术，其中相当一部分是利用链置换反应解开DNA双链模板。链置换反应是指某些DNA聚合酶在延伸新链的过程中如果遇到下游DNA链，可以继续延伸反应并同时将下游双链剥离而产生游离的单链。

其中LAMP体系，常用的链置换DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶，这种酶具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bst DNA Polymerase具有很强的链置换(strand displacement)能力，可应用于核酸的等温扩增反应，如环介导的等温扩增和滚环扩增等。

（3）（RPA）相关酶

RPA技术是一种多酶协作的反应体系。重组酶可与引物结合形成复合体，定位至与引物同源的靶序列，促使引物与模板结合，同时帮助DNA解链，以便启动扩增；单链DNA结合蛋白(SSB)可与被置换出的DNA单链结合，稳定单链结构。Bsu DNA聚合酶也是链置换DNA聚合酶的一种，主要应用于RPA重组酶扩增，其与Bst DNA聚合酶相比，来源、最适反应温度、链置换活性的强弱均不一样。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列；一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应，Bsu DNA聚合酶启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。

• 电泳型（基础型），类似PCR，只是完成DNA/RNA扩增，用琼脂糖凝胶电泳观察结果或与CRISPR技术结合使用。

• 荧光型，在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。

• 试纸型，在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。