【应用】步琦Spiatec二维色谱Sebox 2D-2000——天然产物挖掘方法学2

简介

上海交通大学微生物代谢全国重点实验室白林泉教授课题组与塔里木大学生命科学与技术学院的黄玮副教授利用新疆特有植物罗布麻的叶际微生物组作为一种新资源来探索挖掘功能天然产物。通过叶际微生物组原位共培养，成功激活了沉默基因簇，以质谱成像技术可视化微生物之间的小分子交互，同时使用 Buchi Spiatec 二维色谱 Sebox 2D-2000 系统分离获得目标化合物。本研究方法拓宽了微生物天然产物的挖掘范围，并引入了微生物组在天然产物挖掘中的全新见解。

主要的结果与讨论

一、放线菌在罗布麻（LBM）叶际微生物群落中普遍存在

为了最大化微生物组中微生物物种的多样性，包括那些低丰度的物种，在 96 孔板中进行了稀释分离，以获得实验室环境下的可培养菌株。从1克罗布麻叶片中分离和纯化出 2760 个微生物个体。经过初步的形态学分类，对 275 个分离株进行了全长 16S rDNA 测序，并使用公共数据库进行了分析。在 275 个测序的微生物个体中，鉴定出 44 个单一物种，其中放线菌门、芽孢杆菌门和假单胞菌门分别占 43%、32% 和 25%。

二、在可培养分离株中筛选出相互作用对

为了研究 44 个细菌分离株之间的相互作用网络，总共进行了 1892 对二元相互作用，产生了 238 对（占所有可能配对的 12.6%）相互作用。其中包括 167 对抑制配对（70.2%）和71对促进配对（29.8%）。芽孢杆菌 LBM_47、链霉菌 LBM_605、不动杆菌 LBM_841 和假单胞菌 LBM_128 分别表现出出了不同程度的生长抑制指数，高指数表明菌株在微生物群落内具有较强的生存优势。

三、核心相互作用对引发共存菌株间普遍的代谢变化

结合这些菌株的相互作用效应和代谢潜力，确定了该组中四种主要的放线菌菌株：链霉菌 LBM_605、小单孢菌 LBM_562、红球菌 LBM_791 和诺卡氏菌 LBM_874。基于共培养影响基因表达的潜力及其对微生物组内菌株相互作用的影响，进行了精细的比较代谢组学评估，以表征这四个个体与其余分离株之间的相互作用代谢变化，在所有共培养组合中，84 对与单一培养相比表现出显著的代谢变化，占比 25.3%。表明这四种菌株在与同一微生物群内的邻居相互作用时，可以诱导显著的代谢变化，其中 LBM_791 和 LBM_605 的组合具有最多样化诱导化学实体的生产能力。

四、在 LBM_791 和 LBM_605 共培养中表征激活分子抗霉素

对 LBM_605 和 LBM_791 的大规模共培养发酵进一步进行了 Buchi Sepiatec Sepbox 2D-2000 制备和质谱分析，以追踪和纯化目标激活化合物。借助晶体学分析、质谱和 NMR，对该激活化合物进行了表征，证明是一种已知的天然产物抗霉素（resistomycin）。经基因组测序，抗霉素的生物合成基因簇属于链霉菌 LBM_605，这表明菌株 LBM_605 沉默的抗霉素生物合成基因簇被菌株 LBM_791 诱导激活。

【产物制备平台-Sepbox 2D-2000】

以 Buchi Sepiatec Sepbox 2D-2000 系统为中心，建立了一种用于快速分离目标化合物的新型化合物追踪/制备平台（图2）。该平台包括四个主要部分：步骤a，获取感兴趣的培养液，7~10 天（视菌株而定）；步骤 b，将目标细菌培养物送入 Sepbox 2D-2000 串联色谱系统，将粗提物分级为纯/近纯组分，大约 12 小时；步骤c，将一系列纯/近纯组分送入 MALDI-TOF/MS 以筛选目标离子峰，12小时；步骤d，定位目标组分并进行结构鉴定程序，耗时数周。HTTFP工作流程的核心是步骤b，从理论上讲最多消耗 1 天（图3）。

产品信息与参数

应用场景

• 解密未知世界，助力揭示纷繁复杂的自然现象以及人与自然的和谐共存

• 筛选活性物质，助力先导分子的发现与医药行业的发展，助力大健康行业

• 捕获中间体/节点分子，联通上下游通路，助力化学合成过程与生物合成过程的解析与认知

• 批量制备药物分子、目标化合物，全面助力合成生物学医药行业的蓬勃发展

结论

参考文献

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