【应用】步琦Spiatec二维色谱Sebox 2D-2000——天然产物挖掘方法学

简介

上海交通大学微生物代谢全国重点实验室白林泉教授课题组以化学生态学思路为指导，以改变逆境胁迫因子为手段，开发了以步琦二维色谱 Sebox 2D-2000 为中心的天然产物挖掘方法流程，发现了分离自新疆罗布泊盐湖的稀有放线菌所产生的耐高盐、高金属离子胁迫的次级代谢产物 Thiapyricins，并以晶体学的手段揭示金属离子配位是该类代谢产物发挥金属离子缓冲的结构基础。Thiapyricins A/B（TPC-A/B, 1和2）是一种新型金属载体类天然产物，在金属剥夺的条件下发现，由分离自罗布泊盐湖的稀有放线菌 Saccharothrix sp. TRM_47004产生。TPCs 具有噻唑基-吡啶骨架，对钙离子表现出选择性结合特性，属于钙结合天然产物（钙载体）。其金属螯合特性有助于宿主在金属饥饿条件下通过增加 TPCs 产量来适应环境。本研究展示了一种新型钙载体的结构范式，强调了金属载体的产生与金属栖息环境之间的因果关系。

主要的结果与讨论

一、金属剥夺条件下极端微生物的代谢分化

罗布泊盐湖（北纬 39° 至 41°，东经 88° 至 92°，海拔约 780 米，位于塔里木盆地东缘低洼地区）是中国新疆维吾尔自治区的第四纪干盐湖，金属离子浓度相对较高。从该盐湖采集的稀有放线菌 Saccharothrix sp. TRM_47004 用于研究这种已适应高金属浓度自然栖息地的微生物是否能在代谢水平上响应金属限制条件。采用双硫腙作为金属剥夺剂的反向挖掘策略被引入以刺激代谢分化（图1b）。在金属螯合条件下，Saccharothrix sp. TRM_47004 表现出显著的代谢响应。与含金属条件相比，金属剥夺下菌落颜色从乳白色变为褐色，表明产生了具发色团的特定代谢产物，分别为 m/z 352.1326（峰1）和 338.1172（峰2）（图1c）。

【产物制备平台 - Sepbox 2D-2000】

以 Buchi Sepiatec Sepbox 2D-2000 系统为中心，建立了一种用于快速分离目标化合物的新型化合物追踪/制备平台（图2）。该平台包括四个主要部分：步骤a，获取感兴趣的培养液，7~10天（视菌株而定）；步骤b，将目标细菌培养物送入 Sepbox 2D-2000 串联色谱系统，将粗提物分级为纯/近纯组分，大约 12 小时；步骤c，将一系列纯/近纯组分送入 MALDI-TOF/MS 以筛选目标离子峰，12小时；步骤d，定位目标组分并进行结构鉴定程序，耗时数周。HTTFP工作流程的核心是步骤b，从理论上讲最多消耗1天（图3）。

二、TPC-B 作为响应金属扰动的主要效应物

EDX 分析检测到五种金属离子，ICP-MS 定量分析显示两种 TPCs 螯合多种金属，化合物 2(TPC-B) 表现出更强的金属配位能力，是1的 1.76 倍。其中化合物1(TPC-A) 和 2(TPC-B) 中总金属富集量分别为 17.25 和30.28 μg/mg，两者 TPCs: 金属的摩尔比不同，分别为 7:1 和 4:1。在 1(TPC-A) 中，钙的量是其余金属总和的5.05 倍；在 2(TPC-B) 中，钙的量是其余金属总和的 4.89 倍（图4a）。这一结果无可争议地表明 TPCs 作为一种适当的钙载体，对钙离子具有高选择性。同时Saccharothrix sp. TRM_47004 通过增加 TPCs 产量强烈响应金属螯合环境。当添加 0.7 mM 双硫腙（作为金属剥夺剂）时，1(TPC-A) 的产量在实验组中比对照组高 2.63 倍，而 2(TPC-B) 的产量在实验组中比对照组高1.62倍（图4b），表明化合物 2(TPC-B) 对金属剥夺更敏感。由于双硫腙略有毒性，添加双硫腙导致 47004 生物量降低 48.6%（图4c）。考虑此因素，1(TPC-A)的生产率增加了 65.4%，而 2(TPC-B) 的生产率显著提高了 605.9%。即化合物 2(TPC-B) 是更强大和敏感的螯合剂，以适应环境变化。

产品信息与参数

应用场景

• 解密未知世界，助力揭示纷繁复杂的自然现象以及人与自然的和谐共存

• 筛选活性物质，助力先导分子的发现与医药行业的发展，助力大健康行业

• 捕获中间体/节点分子，联通上下游通路，助力化学合成过程与生物合成过程的解析与认知

• 批量制备药物分子、目标化合物，全面助力合成生物学医药行业的蓬勃发展

结论

参考文献

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