显微课堂 | 基于激光的视神经再生研究新方法

如何利用激光显微切割技术（LMD）对爪蟾蝌蚪的视神经进行精确一致的横切

由于哺乳动物中 枢神经系统（CNS）的自我修复能力有限以及传统损伤模型的不一致性，视神经再生是神经生物学的一大挑战。相比之下，爪蟾蝌蚪的视神经在受伤后可以再生，因此是研究轴突再生的分子和细胞机制的理想模型。在本应用说明中，我们展示了如何利用徕卡激光显微切割技术（Leica LMD）对蝌蚪的视神经进行精确、一致的横切，从而开发出适合成像、转录组分析和功能恢复研究的高重复性损伤模型。

简介

视神经是视网膜和大脑之间的联系纽带，由视网膜神经节细胞（RGC）轴突组成。这些轴突的跨度相对较大，其功能是维持视觉过程。在人类等哺乳动物中，视神经在受伤后的自我修复能力非常有限，往往会导致视力完全丧失。要改善这些患者的治疗效果，我们首先需要充分了解自然界中的物种神经再生的机制。在青蛙身上，视神经受损后会自发地完全再生并恢复视力。这为我们提供了一个理想的模型系统，以了解成功的视神经再生所涉及的基本机制，并为最终在再生能力不足的物种中使用视力保护疗法确定目标途径。

视神经人工损伤模型面临的挑战

使用解剖显微镜手动操作蝌蚪视神经需要高超的显微外科技术，而且动物体型小且易碎，这对手术操作提出了挑战。即使使用微型机械手和精细镊子，人工横切也是一种侵入性操作，很难在不同操作者之间实现标准化，而且往往会导致很高的死亡率。病灶大小和位置可能会有很大差异，从而导致实验重复的不一致性。这些技术限制影响了模型的可重复性，降低了下游分析的统计能力。因此，特别是在需要精确控制视神经损伤的空间或时间的研究中，很难得出可靠的结论。

治疗视神经损伤的新型激光显微切割法

为了开发一种新的手术模型，徕卡显微系统Leica LMD7与Xla.Tg（tubb2b：mapt-GFP）Amaya转基因X. laevis品系一起用于可视化和进行视神经横断及随后的轴突再生。蝌蚪的发育阶段为43-46期。在这些阶段，蝌蚪是透明的，可用于实时荧光成像。简言之，蝌蚪被麻醉后，被放置在由4%琼脂糖制成的特制手术床上，手术床位于腔室载玻片内。蝌蚪的朝向是背朝上平放。使用Leica LMD7软件中的“测量”工具，在放大5倍的情况下，用349 nm徕卡紫外激光切割器在视神经从球状体出口的远端约300 μm处横切每只蝌蚪的左侧视神经。用“绘制”工具在视神经上绘制的线接受四次激光脉冲（120 µJ/脉冲），激光功率为55 mW（脉冲频率 = 2710），采用激光螺旋模式（步数 = 2，步长 = 5 μm，重复次数 = 2），以切割到适当深度并横切神经。荧光视神经显像中的缺口确认了切割。然后立即取出蝌蚪，在1X MMR培养基中复原，并用于随后的下游实验。

图 1：新型激光模型可实现精确且可重复的视神经切断。

A) 使用Xla.Tg (tubb2b: mapt-GFP) Amaya转基因X. laevis品系的徕卡Leica LMD7显微实验装置。
B) 蝌蚪在麻醉后被放置在腔室载玻片内由4%琼脂糖制成的小型手术台上，使其背侧朝上并保持平坦。
C) GFP通道中术前和术后内源性标记的视神经图像。术后图像中荧光间隙表明视神经已成功切断。
D) 三只蝌蚪的代表性图像，显示该徕卡激光模型在精确性和可重复性方面的表现，其视神经均在距离眼睛相同的位置被切断。

结果

这种激光显微切割方法可实现高通量、可重复和微创的视神经横切，从而在损伤后短时间内实现强大的视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生。利用徕卡（Leica）LMD7的精确性，可确保不同生物复制中病变位置的一致性，这对下游分析至关重要。该模型已被应用于通过纵向共焦成像研究轴突动态、绘制结构变性和再生（约14天）的时间表、研究细胞死亡和增殖、评估视觉通路恢复，以及通过RNA-seq描述早期转录组反应的特征。此外，该方案还与其他转基因蝌蚪品系兼容，如表达基因编码传感器的蝌蚪品系。例如，Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR 株系被用来观察激光损伤开始时视神经中的钙动态。

结论

这种基于LMD激光的方法提供了所需的精确度，可产生一致的病变，同时将脱靶损伤降至最低，克服了人工技术的局限性。因此，它为研究中 枢神经系统再生机制提供了一个功能强大且可重复的平台。该模型可用于未来的定向基因操作实验，从而扩展再生神经科学研究的工具包。

实验产品

徕卡Leica LMD7 激光显微切割

以较高的精度和速度实施切割

使用“移动切割”技术，进行直接、实时地切割

重力收集，大限度地避免样品污染

参考文献：

1. Moulin, C.、Dvoriantchikova, G.、Bineshfar, N. 等人. 新型视神经横断激光模型为视神经再生动力学提供了宝贵的见解。科学报告 14，27412（2024 年）。