摘要
国内ADC研发已进入白热化竞争阶段，靶点扎堆、临床内卷、工艺与制剂成为真正的决胜点。在FDA、EMA及国内药监部门日趋严格的监管要求下，仅用质谱测定药物抗体比(DAR)早已无法满足完整表征需求。[1]
抗体偶联过程对分子稳定性、聚集趋势、抗原结合亲和力的影响，直接决定产品的安全性、 有效期与成药性。
本文基于沃特世材料科学官方实验数据，系统介绍TA仪器Nano DSC、RS-DSC和Affinity ITC在ADC研发中的实际应用，为研发与申报提供可直接参考的技术路径。
本文将结合完整实验数据详解两大技术在ADC研发中的实战应用，文末更有制药全赛道专属线上课堂专题计划与报名通道，其中生物药研发专属课程可帮您进一步吃透ITC与DSC的全流程应用，均可免费预约报名哦～
引言
抗体药物偶联物(ADCs)是一类前沿生物制药产品，将高选择性的单克隆抗体与强效细胞毒性小分子结合，已成为肿瘤靶向治疗的重要方向。目前全球已有14款ADC获批上市，数百个项目处于临床与研发阶段。[2]
由于ADC兼具生物大分子与小分子药物双重属性，FDA、EMA等监管机构均要求对其进行双重表征，既要明确DAR、偶联位点，也要评估高级结构稳定性与抗原结合功能。
质谱(MS)长期以来是测定DAR的标准手段，但无法提供：
偶联后抗体热稳定性变化
聚集与解折叠趋势
抗原结合的完整热力学信息
制剂缓冲液对稳定性的细微影响
借助TA仪器的Nano DSC纳瓦级差示扫描量热仪和Affinity ITC等温滴定量热仪，研究人员可以在溶液状态下、无标记、原位表征ADC稳定性与结合行为，弥补质谱短板。
偶联的不稳定效应：
DSC实验分析
偶联引发的稳定性风险
在ADC制备中，疏水性小分子药物偶联到亲水性抗体上，会破坏水分子网络与分子间次级相互作用，导致结构不稳定。不稳定的ADC易出现各种问题：[3]
- 小分子药物提前释放
- 抗体聚集、沉淀
- 脱靶毒性增加
- 疗效与安全性大幅下降
Nano DSC
亲本抗体与ADC稳定性对比实验
TA仪器的Nano DSC是一款用于稀溶液中生物分子稳定性测量的微量热仪，可轻松完成稳定性表征。图1展示了曲妥珠单抗(亲本抗体)与T-DM1(赖氨酸偶联ADC)的Nano DSC升温扫描曲线。亲本单克隆抗体在70℃以下保持稳定，而该ADC的聚集和解折叠起始温度低至45℃。这种向左的热偏移表明稳定性降低；该数据可帮助研发人员在制剂开发早期预测产品保质期和聚集风险。
图1：曲妥珠单抗(亲本抗体)
与T-DM1(赖氨酸偶联物)的Nano DSC分析
联盟蛋白质实验室(Alliance Protein Laboratories)的研究人员发表了一项类似研究，利用Nano DSC探究偶联反应引发的结构和稳定性变化。他们发现，当芳香族分子与抗体偶联后，分子热稳定性会下降，而这一变化可通过Nano DSC轻松检测到。[4]
RS-DSC
高通量制剂缓冲液筛选实验
制剂筛选还需要在多种市售缓冲液中测试ADC的性能。Nano DSC能够检测不同缓冲液环境下解折叠曲线的细微变化，帮助科研人员筛选最优制剂配方，以抵消偶联反应带来的不稳定性。为满足更高通量需求，TA仪器的快速筛选差示扫描量热仪(RS-DSC)可同时检测多达24个样品，且支持浓度高于20mg/mL的制剂级样品。以下案例中，研究人员使用RS-DSC测试了赫赛汀(曲妥珠单抗)在组氨酸、硼酸盐、磷酸盐缓冲液(PBS)和琥珀酸盐缓冲液中的热稳定性。[5]
图2与表1：使用RS-DSC对50mg/mL浓度的抗体
进行三次重复扫描，通过自动Tmax
和基线检测生成的叠加热谱图
组氨酸、硼酸盐和PBS缓冲液对第一个解折叠过程无显著影响，但琥珀酸盐缓冲液会使CH2结构域不稳定，导致解折叠起始温度和Tmax,?降低约3℃。在主要的热转变过程中，组氨酸和琥珀酸盐缓冲液的稳定效果最佳。不出所料，在本组样品中，曲妥珠单抗最稳定的缓冲液配方正是已获批药品最终制剂所使用的组氨酸缓冲液。
抗原结合亲和力表征：
ITC实验与热力学分析
偶联对结合亲和力的潜在影响
ADC的研发需要对抗体进行修饰，以实现药物偶联，提高肿瘤靶向性和体内清除率。然而对抗体的修饰(疏水性改变、CDR区附近赖氨酸非特异性偶联)可能削弱抗原结合能力，直接影响药效。
传统的表面等离子体共振(SPR)和生物层干涉法(BLI)可测结合动力学参数，但只有等温滴定量热法(ITC)这种直接的溶液内检测方法能提供完整的结合热力学信息：
结合焓变ΔH
熵变ΔS
结合计量比
解离常数Kd
ITC是精细结合表征的金标准，且ITC在溶液中无固定、无标记，可避免SPR和BLI中常见的假信号。
例如以下ITC实验数据分别展示了曲妥珠单抗亲本抗体和其ADC与HER2抗原结合的滴定结果。该曲妥珠单抗ADC的解离常数(~3 nM)与亲本抗体相当，焓变(-96 kJ/mol)也与亲本抗体相似。ITC对于确认抗体的任何修饰未对其结合亲和力和特异性产生不利影响至关重要。
图3：ITC结合等温线：A)亲本抗体(曲妥珠单抗)；
B)ADC在天然无固定条件下与HER2的结合
从异质性到双药ADC：
新一代ADC的结构复杂性
与量热技术价值
随着ADC技术的不断发展，其结构复杂性也日益增加。
第一代：
依赖赖氨酸偶联，DAR分布宽(0-8)，会产生高度异质混合物
第二代：
采用半胱氨酸偶联，DAR更均一(≈4)，但会破坏链间二硫键
第三代：
位点特异性偶联(工程半胱氨酸/非天然氨基酸)、双药ADC，结构更精准也更复杂
技术演进带来了新的分析挑战，也暴露了现有分析手段的局限。尽管液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术仍是定位偶联位点和计算平均DAR的核心工具，但它无法全面反映结构修饰带来的热力学变化。
随着偶联位点数量、药物类型和连接子化学的不断拓展，Nano DSC应对复杂ADC的价值日益显现。Nano DSC可直接测定解折叠转变温度、聚集起始温度以及不同偶联位点/连接子/载荷对稳定性的影响，从而在早期判断新型ADC在实际应用条件下是否能保持稳定，是否会发生聚集或析出，降低后期开发风险。
结论
ADC的成功开发必须建立全面、多维度的表征体系，不能仅依赖质谱。沃特世可提供完整的解决方案，赋能新一代ADC及各类抗体药物的研发加速。
1.
Nano DSC / RS-DSC可助您解决稳定性问题——定量评估偶联对抗体高级结构的破坏
? 高通量筛选制剂缓冲液
? 预测聚集风险与货架期
? 满足FDA/EMA高级结构评价要求
2.
Affinity ITC可助您解决结合功能问题——无标记、原位测定Kd、焓变、计量比
? 确认偶联不损害抗原亲和力
? 提供SPR/BLI无法实现的完整热力学数据
3.
质谱+ DSC + ITC联用策略——完整表征方案
DAR与位点+稳定性+结合功能的综合探索可显著提升ADC研发成功率、满足申报要求、加速产业化进程
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参考资料
1.
Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates Guidance for Industry. FDA-2021-D-1051; Center for Drug Evaluation and Research and Center for Biologics Evaluation and Research: 2024. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/clinical-pharmacology-considerations-antibody-drug-conjugates-guidance-industry
2.
1. Fu, Z.; Li, S.; Han, S. et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy 7, 93 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7
3.
Fisher, J. E. Jr. Considerations for the Nonclinical Safety Evaluation of Antibody-Drug Conjugates. Antibodies (Basel) 10, 2 15 (2021). https://doi.org/10.3390/antib10020015
4
Arakawa, T.; Kurosawa, Y.; Storms, M.; Maruyama, T.; Okumura, C. J.; Maluf, N. K. Biophysical characterization of a model antibody drug conjugate. Drug Discoveries & Therapeutics, 10, 4 (2016). https://doi.org/10.5582/ddt.2016.01042
5.
Nervig, C. Rapid Thermal Stability Screening and Selection of Monoclonal Antibody Drug Products. TA Instruments: 2024. https://www.tainstruments.com/applications-notes/rapid-thermal-stability-screening-and-selection-of-monoclonal-antibody-drug-products-mc178/
致谢
本文改编自Shawn C. Owen博士为沃特世-TA仪器与生物工艺在线(Bioprocess Online)合作举办的网络研讨会内容，由沃特世材料科学事业部的Morgan Ulrich、Calliste Scholl和丁纯洁撰写，范洋晶校对。
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