研究聚焦于与神经发育障碍相关的KCNH1变体，深入探讨了其功能后果，发现多数变体呈现功能获得性特征，并进一步分析了其对静息膜电位的影响及潜在的治疗策略。

图1 KCNH1基因变异位点分布示意图。本图基于简化后的KCNH1蛋白结构模型，标示了本研究涉及的所有变异位点：黑色圆点表示在人群数据库（如gnomAD）中报道的良性或意义未明变异；红色圆点表示既往文献已证实与疾病明确相关的致病性变异；蓝色圆点表示本研究新确认的、经功能实验及临床表型支持的致病性变异（此前未见正式发表）。对于同一密码子发生的多重氨基酸替换（如K354E/N），图中同时标注两种替代形式，但统一采用对应致病性等级的颜色符号予以标识。

KCNH1变体与基因型－表型关联

·变体筛选与来源：研究从Human Gene Mutation Database（HGMD）、ClinVar、KCNH1国际注册库以及Genome Aggregation Database（gnomAD）中精心挑选了26个与疾病相关的KCNH1错义变体，其中包括3个复发变体和5个尚未发表的变体，同时还选取了6个罕见人群变体。变体基于KCNH1转录本异构体1（NCBI RefSeq NM_172362）的氨基酸序列编号，人群变体的次要等位基因频率大于0.00005。

·临床特征：大多数疾病相关变体与Temple-Baraitser综合征（TBS）或Zimmermann-Laband综合征（ZLS）的重叠临床特征相关，包括肌张力低下、发育迟缓、智力障碍、癫痫，以及牙龈增大、面部和手指畸形、拇指和脚指甲发育不全或缺失等可变表现。部分变体（如R520W、V569M、V713E）与非典型综合征相关，如突出的癫痫表型、孤独症队列或仅癫痫无TBS/ZLS特征。V713E在ClinVar中被归类为可能良性，部分疾病相关变体（R520Q、V569M）在gnomAD中低频出现，其余则未在gnomAD中出现。

KCNH1变体的功能后果

·实验方法：采用自动化膜片钳技术，在HEK293T细胞中异源表达KCNH1变体，分别在纯合状态（仅变体）和临床相关的杂合状态（变体与野生型共表达）下记录。通过流式细胞术检测共转染效率，平均为86.1 ± 1.1%（95%CI），共分析6821个记录细胞。

·电流密度：在纯合状态下，除了G496E、G496R和R520W这三种变体外，其他变体的电流密度均高于内源性电流；在杂合状态下，人群中的变体电流密度与野生型相比没有显著差异，而在疾病相关变体中，仅G496R变体的电流密度显著降低了65%。

·激活动力学：在+10 mV测试电位下，11个疾病相关变体（如K217N、N238D、S352Y等）激活速度快于野生型，L379P激活速度慢于野生型，人群变体中仅R791H激活较慢。部分变体（如K354E、R357Q）激活起始迅速或存在瞬时激活。

·激活电压依赖性：17个疾病相关变体在杂合状态下表现出超极化的激活电压依赖性，如K354E的ΔV1/2为-12.9 mV，R357Q为-4.4 mV；仅V569M表现去极化（ΔV1/2为+10.8 mV）。部分变体（如K199R、V713E）在纯合和杂合状态下均无显著功能差异，部分变体（如V383L、A492S、T493N）仅在纯合状态下表现出显著的功能差异，而R520Q和R520W在纯合状态下会导致多参数异常，但在杂合状态下则表现正常。

KCNH1剪接异构体在人脑皮质中的表达及对变体功能的影响

·剪接异构体表达：KCNH1基因存在两种主要剪接异构体，即长异构体（异构体1，含989个氨基酸）和短异构体（异构体2，含962个氨基酸，缺失外显子6的81 bp）。通过下一代测序技术分析18孕周至20岁的人脑皮质样本，发现这两种异构体均有表达，其中异构体2的表达量约为异构体1的两倍。此外，异构体1在儿童期的贡献略高于产前阶段，但并未表现出显著的发育调控特征。

·异构体对变体功能的影响：与异构体1相比，异构体2产生的全细胞电流略大，其激活电压依赖性更偏向去极化，且激活动力学过程更慢。R357Q在异构体2中表现出的超极化激活电压依赖性差异更为显著（异构体1：ΔV?=-13.7 mV；异构体2：ΔV?=-24.6 mV）。 mV）。A492S突变在异构体2中表现出显著的激活差异，其中纯合状态下的ΔV?为-29.5 ± 4.9 mV（P<0.0001），而杂合状态下的ΔV?为-17.5 ± 2.9 mV（P<0.0001）。这表明纯合突变相较于杂合突变对V?的激活有更显著的影响。然而，在异构体1中，这种统计学上的差异并不显著。V383L、A492S、T493N在异构体2杂合状态下表现出显著功能差异，V569M在异构体2中峰电流密度显著降低。

KCNH1变体对静息膜电位的影响

·静息膜电位测量：野生型KCNH1表达使HEK293T细胞静息膜电位（RMP）超极化至-61.4 ± 0.8 mV，非转染细胞为-17.5 ± 3.1 mV。人群变体对RMP无显著影响，21个疾病相关变体在杂合状态下诱导RMP显著超极化。A492S和T493N仅在异构体2中表现RMP超极化，V569M在异构体2中使RMP去极化。R520Q和R520W在杂合状态下不影响RMP。

·相关性分析：激活电压依赖性的变化与RMP超极化程度显著相关（P<0.0001），这与抗心律失常药物对心房静息膜电位钠通道敏感性影响的研究结果一致，表明RMP的变化直接改变了药物的疗效。G496R虽杂合状态电流低，但仍与RMP超极化相关，表明激活电压依赖性的改变是RMP超极化的主要驱动因素。

KCNH1功能获得性变体的药物再利用

·药物选择与实验：选择丙米嗪（已批准用于儿科，hERG阻断风险较低）和研究性化合物LY97241（非选择性钾通道阻滞剂），测试其对野生型及三个功能获得性变体（R357Q、I494V、G375R）的阻断效力。

·抑制效果：LY97241对野生型KCNH1的IC50为0.024 ± 0.005 μM，显著强于丙米嗪（IC50=1.9 ± 1.1 μM）。I494V对丙米嗪的敏感性是野生型的6倍（IC50=0.3 ± 0.1 μM），LY97241对R357Q和G375R的抑制效力约为野生型的2倍，表明存在变体特异性药理学差异。

总体结论

·主要发现：大多数与神经发育障碍相关的KCNH1变体表现出功能获得性特征，包括超极化的激活电压依赖性、加速的激活动力学或两者兼具，导致细胞静息膜电位超极化。例如，KCNB1基因变异相关癫痫和发育落后患儿的临床特点分析显示，KCNB1基因变异导致的癫痫发作和发育落后可能与KCNH1基因变异导致的类似功能获得性特征有关。KCNH1的可变剪接可影响疾病相关变体的功能特性，部分变体在不同异构体中表现出差异。丙米嗪和LY97241对特定KCNH1变体具有更高的抑制效力，提示药物再利用的潜在可能性。

·研究意义：这些发现阐明了KCNH1相关疾病的分子病理机制，支持功能获得性为主要机制，并为开发针对性治疗策略（如药物再利用）提供了实验依据，有助于推动KCNH1相关神经发育障碍的精准治疗。

补充材料  

表S1 本研究中使用的引物序列  

图S1 纯合状态下KCNH1变异体的平均全细胞电流轨迹  

图S2 杂合状态下KCNH1变异体的平均全细胞电流轨迹  

图S3 人类大脑组织发育过程中KCNH1剪接异构体的时空表达谱  

图S4 KCNH1不同剪接异构体功能特性的比较分析  

图S5 异构体2中KCNH1变异体的平均全细胞电流轨迹  

图S6 ΔRMP与激活时间常数相对变化倍数之间的相关性分析  

图S1. KCNH1基因纯合变异体的平均全细胞电流响应曲线。数据表示KCNH1各变异体在电压钳记录下获得的平均标准化全细胞电流（n = 7–57个独立细胞）。

图S2. KCNH1基因杂合变异体在全细胞膜片钳记录中所测得的平均电流轨迹（n = 15–94）。

图S3. KCNH1基因剪接异构体在人类大脑组织发育过程中的动态表达谱。横轴表示发育时间点（孕后18周至20岁），纵轴表示各剪接异构体占KCNH1总mRNA的相对丰度（n = 2–7个独立生物学样本）。

图S4. KCNH1剪接异构体的功能特性比较。（A）野生型异构体1（黑色）与异构体2（绿色）的平均全细胞电流响应轨迹；（B）平均电流–电压（I–V）关系；（C）平均电导–电压（G–V）关系；（D）在+10 mV去极化电压下激活时间常数（τact）的统计汇总；（E）异构体1（圆形符号）与异构体2（方形符号）中野生型（黑色）及R357Q突变体（蓝色）的平均G–V关系。所有数据均以均值±95%置信区间（CI）表示，样本量n = 161–504个独立转染细胞。

图S5. KCNH1基因变异体在2型同种异构体中所介导的平均全细胞电流轨迹（n = 14–107）

图S6. ΔRMP与激活时间常数倍数变化之间的相关性分析。横轴表示激活时间常数的倍数变化（τ_act,mut/τ_act,wildtype），纵轴表示静息膜电位的变化值（ΔRMP，单位：mV）。数据点呈显著正相关（线性回归拟合，R2 = 0.68，P = 0.0192；红色实线为回归线）。其中，圆形符号代表同种型1（isoform 1）来源的实验数据，方形符号代表同种型2（isoform 2）来源的实验数据。