mRNA药物革命：翌圣镁孚泰的T7 RNA聚合酶突变体如何实现“低毒”突破？

mRNA技术作为一种新兴的生物技术，具有巨大的应用潜力。从 mRNA 疫苗到 mRNA 药物，这一技术为疾病的预防和治疗提供了全新的思路。然而，mRNA 技术的发展并非一帆风顺，其中最大的挑战之一便是副产物双链 RNA（dsRNA）的形成。dsRNA 作为一种免疫刺激分子，会引发机体的免疫反应，从而影响 mRNA 的安全性和有效性。因此，如何减少 dsRNA 的形成，成为 mRNA 技术领域亟待解决的关键问题。

传统解决方案依赖繁琐的纯化工艺，但成本高、效率低，且难以彻底清除微量dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具酶，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的关键因素，如何通过定向进化或理性设计改造T7 RNAP，成为全球科研团队竞逐的焦点。

我们创新性的通过结合定向进化和半理性设计的方法，成功筛选出多个高效低毒的T7 RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现出色。

我们构建了随机突变库，设计了一种可实时监测液滴内RNA产物的完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）定向进化技术进行超高通量筛选。最终筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）、Mut7（F162S/A247T）产生的dsRNA含量显著低于野生型。

同时，我们通过半理性设计方法，构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术来识别有益的突变体。其中，微孔板筛选使用了双探针，增加的5’-end探针用于检测RNA产量。在筛选超过1000个突变体后，发现了关键候选突变体Mut11 (K180E)、Mut14 (A70Q)产生的dsRNA含量显著低于野生型，并且未影响转录效率。

为了进一步优化，我们针对上述突变位点构建了DNA shuffling文库，通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的1.8%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。

这一结果不仅在体外实验中得到了验证，还在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA可有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗潜力。

为了深入了解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验，揭示了突变体是由于降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而导致dsRNA的降低，这一发现为未来进一步优化 T7 RNAP提供了重要的理论依据。

本研究为T7 RNAP的改造提供了新的方法与思路，也为 mRNA 技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的形成，提升了 mRNA 的质量和安全性。