快速无菌检查方法之——呼吸信号法 | 泰林智能微生物检测解决方案

《中国药典》1101无菌检查法中明确指出，无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。该经典方法需要至少培养14天以观察微生物生长信号。

随着微生物分析技术的发展，制药领域引入了新的微生物检验技术。相较于传统的微生物检验方法，新技术通常具有快速、可实现实时或近实时监控等优势。2024年5月底发布的《9201药品微生物检验替代方法指导原则公示稿（第二次）》中，将微生物检验新技术分为了3类：①检测微生物生长信息的技术；②直接测定活微生物的技术；③分析微生物细胞中特定成分的技术。

呼吸信号法是基于检测微生物生长信号的仪器方法，采用商品化全自动微生物培养系统，通过仪器实时监测微生物生长代谢产生的二氧化碳引起的培养瓶内反应底物的显色或荧光变化信号，或培养瓶顶空压力变化信号，结合目视观察，判定供试品中有无微生物生长。

团标 《T/SHA 012-2022细胞和基因治疗产品快速无菌检查法的验证技术要求》在附录A中指出，“目前细胞和基因治疗产品主要应用的快速无菌检查法主要采用基于微生物生长的原理，其中检测微生物呼吸信号的方法为目前最常见的类型”，包括基于二氧化碳底物显色的检测技术^★、基于荧光增强显示的检测技术、基于气压感应的检测技术等等。

这类检测技术通过仪器配套的专用培养瓶进行培养，微生物增殖所累积的产物CO₂可引起瓶内H⁺浓度变化，培养瓶底部显色硅胶感应器会与H⁺结合而产生颜色变化，从而被仪器检测记录。仪器每隔一定时间即会检测每个孔位中培养瓶底部的显色硅胶的颜色变化，根据这种实时读数结果绘制信号曲线，之后综合特有的算法对信号曲线进行分析，从而判断阳性与阴性结果。

大幅缩短无菌检查时间，可直接接种培养物，灵敏度较高，需要样品量较少，不受产品相关浊度的干扰，减少人工观察产生的误判。

①若样品中含抗生素，可能会出现假阴性。

②需进行风险评估。团标指出，采用本方法应在充分考虑制品生产工艺、无菌保障水平、微生物（尤其是慢生长微生物）污染风险、使用者获益/风险等因素的基础上，经风险评估后有条件地实行。

③需考虑环境分离菌株。团标中指出，应根据产品的来源、特点及产品既往微生物污染情况，增加环境分离菌株，尤其是在生产环境监测中获得的分离菌株，尽可能选取不同种类微生物，特别是慢生长微生物，并尽可能将其鉴定到种。