传统定量PCR方法

定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术。下面就让小编为你具体介绍一下吧。

一、传统定量PCR方法

1）竞争法：

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，用同一对引物同时扩增待测样品与竞争模板。扩增后PCR产物用内切酶消化。酶将竞争性模板的产物分解成两个片段，而待测模板不被酶切，两种产物可通过电泳或GX液相分开，对它们的荧光强度分别进行测定，未知模板的起始拷贝数据已知模板推测。

2）PCR－ELISA法：

利用地 高 辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地 高 辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，Z终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

3）内参照法：

将已定量的内标和引物加入到不同的PCR反应管中，内标用基因工程方法合成。下游引物不标记，上游引物用荧光标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，因为靶模板的长度和内标不一样，电泳或GX液相可以将二者的扩增分离开来，对它们的荧光强度分别测定，待检测模板的定量是通过对照内标。

二、内标在传统定量中的作用

因为PCR到达平台期后进行检测是传统定量方法。但是PCR经过对数期扩增到达平台期时，具有很差的检测重现性极差，所以起始模板量无法直接从终点产物量推算，将内标加入后，可以使得产物定量所造成的不准确性部分消除。

三、内标对定量PCR的影响

若将已知起始拷贝数的内标加入到待测样品中，那么PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争特别是两种模板的起始拷贝数有比较大的差距时，会表现出更加明显的竞争关系。然而因为待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标