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PCR对DNA片段进行扩增仅仅是一个重要的手段。目的是为了检测和分析扩增片段。分析法的选用取决于研究的对象和研究的目的。扩增产物的大小可以通过琼脂糖凝胶电泳的判断,其对鉴定扩增产物有所帮助。点杂交不仅可以对扩增产物进行鉴定,而且还能帮助产物的分型。特异产物的大小通过Southern杂交分析能够从非特异扩增产物中被鉴定出来。如PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等Z近发展的一系列产物分析法均对产物的精确分析有所帮助。
1.PCR-ELISA
这种方法没有电泳和杂交的步骤,适于常规ELISA记数仪检测。犹豫5'端修饰后依然能够对特异靶序列进行常规PCR扩增,所以,可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因,而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。
2.微孔板夹心
这种方法是通过PCR产物的某一区域和固定在微孔板的捕获探针特异杂交在微孔板上间接地固定产物。然后,再用PCR产物的另一区域和非放射性标记物标记的检测探针杂交,漂洗后显色即可判断结果,这种方法是检测一个产物需要两个杂交过程,所以,和一次杂交的检测法相比,两次杂交的特异性更加的高。这种方法和PCR 32P探针的Southern杂交法有着不相上下的敏感性和特异性。然而PCR微孔板夹心杂交法操作更加的迅速,简单,使同位素标记探针的危害得以避免。其非常适用于常规临床实验。
3.凝胶电泳
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳能够有助于检测PCR产物,Z常用的是琼脂糖凝胶电泳,扩增产物的大小能够通过电泳判断出来。在临床检测中,检测的需要只通过凝胶电泳判断扩增片段大小就能够得到满足。将1.5g琼脂糖加入100mlTBE,在微波锅内溶解,稍稍冷却后倒入电泳槽,这是通常的制胶方法。
电泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去离子水漂洗2次,每次15min,在UV灯下观察结果并拍照。
凝胶电泳除了能够用来对产物的大小进行鉴定和扩增的情况进行检测以外,还能够对扩增产物进行纯化。
4.点杂交
若扩增产物是多条带,则更合适的方法为点杂交。这种方法的基本过程为:首先,在尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上固定好扩增的DNA,再使用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交对突变DNA的突变类型检测也有帮助,可以被用来分型某些基因和诊断人类遗传病。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测具有敏感性、特异性和可靠性。对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。然而因为同位素不稳定且具有放射性,不能够在常规的临床或法医检验中使用。更加安全且方便的方法是用非放射性物质(生物素、荧光素和地 高 辛等)标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异。非放射性标记物质不但稳定性高,而且使用方便、安全、检测速度快。
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