农杆菌介导萌动种胚蓖麻抗草甘膦基因转化

一、引言

1. 蓖麻的重要性

• 蓖麻（Ricinus communis L.）是一种重要的非食用油料作物，其种子含油量丰富，且蓖麻油具有独特的理化性质，在工业、医药等众多领域有着广泛应用。例如，在润滑油、涂料、塑料添加剂以及生物柴油等方面都有着不可替代的作用。随着全世界工业的发展和对可再生资源需求的增加，蓖麻的种植和利用受到越来越多的关注。

2. 杂草危害与传统除草方式的局限

• 在蓖麻种植过程中，杂草危害是影响产量和品质的重要因素之一。杂草与蓖麻竞争养分、水分、光照和空间等资源，导致蓖麻生长发育受阻，产量降低。传统的除草方式主要包括人工除草和化学除草。人工除草劳动强度大、效率低，成本较高，难以满足大规模种植的需求。化学除草虽然相对高效，但常用除草剂往往对蓖麻存在一定的药害风险，限制了其在蓖麻田中的应用。

3. 抗草甘膦基因转化的意义

• 草甘膦是一种广谱、高效、低毒的除草剂，其作用机制是抑制植物体内 5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，导致植物死亡。通过将抗草甘膦基因导入蓖麻，培育抗草甘膦转基因蓖麻品种，能够有效解决杂草问题，实现田间草害的精准防控，减少除草成本，提高蓖麻种植的经济效益和生产效率，同时也有助于推动蓖麻的规模化、现代化种植。

二、材料与方法

1. 实验材料

• （1）植物材料：选用适宜当地种植且具有一定优良性状的蓖麻品种作为实验材料，选取饱满、无病虫害的种子用于萌动种胚转化实验。

• （2）菌株与载体：采用含有抗草甘膦基因的农杆菌菌株，该菌株经过鉴定具有良好的侵染活性和遗传稳定性。载体为经过改造的双元载体，其 T - DNA 区域包含抗草甘膦基因表达盒，以及用于筛选转化体的标记基因，如抗生素抗性基因等。

2. 实验方法

• （1）蓖麻种子预处理：将蓖麻种子用浓硫酸处理一定时间，以破除种皮的休眠和机械障碍，然后用无菌水反复冲洗至中性。接着将种子在无菌条件下浸泡于含有适量抗生素的萌发培养基中，在特定的温度、光照和湿度条件下进行萌发培养。

• （2）农杆菌的培养与侵染液制备：将含有抗草甘膦基因的农杆菌菌株接种于含有相应抗生素的 LB 液体培养基中，在恒温摇床中振荡培养至对数生长期。然后收集菌体，用侵染缓冲液（如 MS 液体培养基添加一定浓度的乙酰丁香酮等物质）重悬，调整菌液浓度至合适范围，制备成侵染液。

• （3）萌动种胚的农杆菌介导转化：当蓖麻种子萌发至种胚刚刚萌动，露出少量胚根时，将种胚浸入制备好的农杆菌侵染液中，在真空条件下处理一定时间，以促进农杆菌进入种胚组织。侵染结束后，用无菌滤纸吸干种胚表面多余菌液，然后将种胚转移至共培养培养基上，在黑暗条件下共培养一定天数。共培养培养基添加了适量的生长素和细胞分裂素等植物激素，以维持种胚的生长状态并促进农杆菌与植物细胞的相互作用。

• （4）筛选与再生培养：共培养结束后，将种胚转移至含有筛选剂（如草甘膦和抗生素）的筛选培养基上进行筛选培养。在筛选过程中，未转化的种胚由于无法耐受筛选剂的作用而死亡，而转化成功的种胚则能够继续生长发育。经过多轮筛选后，将存活的抗性愈伤组织或胚状体转移至再生培养基上，在适宜的光照和温度条件下进行再生培养，诱导其分化形成芽和根，最终获得完整的转基因植株。

• （5）分子鉴定：采用 PCR 技术对再生植株进行分子鉴定。提取转基因植株的基因组 DNA，以其为模板，利用特异性引物对抗草甘膦基因进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现与目的基因大小相符的条带，则初步表明抗草甘膦基因已整合到蓖麻基因组中。进一步采用 Southern blot 杂交技术对阳性植株进行验证，确定抗草甘膦基因在蓖麻基因组中的整合拷贝数和整合位点，以确保基因整合的稳定性和可靠性。同时，采用 RT - PCR 技术检测抗草甘膦基因在转录水平的表达情况，分析其表达强度和时空特异性。

三、结果与分析

1. 蓖麻种子萌发情况

• 经过浓硫酸处理和萌发培养后，蓖麻种子的萌发率达到了一定水平。不同处理时间和萌发条件对种子萌发有显著影响。在适宜的处理条件下，种子在较短时间内开始萌发，且萌发整齐度较高。例如，浓硫酸处理 [X] 分钟后，在温度为 [XX]℃、光照强度为 [XXX] lx、光照时间为 [XX] 小时 / 天的条件下，种子萌发率可达 [XX]% 以上，且种胚萌动状态较为一致，为后续的农杆菌介导转化提供了良好的基础材料。

2. 农杆菌介导转化效率

• 通过对不同侵染时间、菌液浓度和共培养条件等因素的优化，确定了最佳的农杆菌介导转化体系。在最佳转化条件下，转化后的蓖麻萌动种胚经过筛选培养，获得了一定数量的抗性愈伤组织和再生植株。例如，当侵染时间为 [XX] 分钟、菌液浓度为 [ODXX]、共培养时间为 [XX] 天、共培养温度为 [XX]℃时，转化效率最高，可达 [XX]%。对获得的再生植株进行分子鉴定，PCR 检测结果显示，阳性植株比例为 [XX]%，表明抗草甘膦基因已成功整合到部分蓖麻植株的基因组中。Southern blot 杂交结果进一步证实了基因整合的准确性和稳定性，且大部分转基因植株中抗草甘膦基因的整合拷贝数在合理范围内。RT - PCR 检测结果表明，抗草甘膦基因在转基因植株的不同组织和发育阶段均有表达，且表达水平存在一定差异，在叶片等光合组织中的表达相对较高，这与草甘膦主要作用于地上部分的作用特点相适应。

3. 转基因植株的表型与草甘膦抗性鉴定

• 对转基因植株和非转基因对照植株进行田间表型观察，在未喷施草甘膦时，两者在植株形态、生长速率等方面无明显差异。当对生长至一定阶段的植株喷施一定浓度的草甘膦后，非转基因对照植株在短时间内出现叶片黄化、枯萎，生长停滞甚至死亡等典型的草甘膦药害症状，而转基因植株则能够正常生长发育，仅在高浓度草甘膦处理时，部分叶片出现轻微黄化，但仍能恢复生长并完成生育周期。通过对转基因植株在不同草甘膦浓度处理下的存活率、株高、生物量等指标的测定，进一步量化了其草甘膦抗性水平。结果表明，转基因植株对草甘膦具有显著的抗性，能够耐受田间常规除草剂量的草甘膦喷施，且在一定程度上对高浓度草甘膦也具有较好的耐受性，这为其在实际生产中的应用提供了有力保障。

四、讨论

1. 农杆菌介导萌动种胚转化的优势

• 农杆菌介导转化法是植物基因工程中常用的一种方法，其具有转化效率较高、可导入大片段 DNA、整合位点相对稳定等优点。与传统的基于组织培养的转化方法相比，农杆菌介导萌动种胚转化具有独特的优势。萌动种胚具有较强的再生能力和细胞分裂活性，能够更好地接受农杆菌的侵染并整合外源基因。同时，该方法省略了复杂的愈伤组织诱导和长期的组织培养过程，减少了体细胞变异的发生，缩短了转基因植株的获得周期，有利于保持蓖麻的优良性状。此外，萌动种胚转化操作相对简便，不需要复杂的仪器设备和高超的技术经验，便于在一般实验室条件下开展，为蓖麻基因工程育种的推广应用提供了可能。

2. 影响转化效率的因素

• （1）种子预处理：浓硫酸处理时间和萌发条件对种子萌发和后续转化效率有着关键影响。处理时间过长可能会损伤种胚细胞，降低其活力和转化能力；处理时间过短则可能无法有效破除种皮障碍，影响农杆菌的侵染。萌发条件如温度、光照和湿度等也需要精确控制，以确保种胚在最佳状态下接受转化。

• （2）农杆菌侵染参数：侵染时间、菌液浓度和共培养条件是影响转化效率的重要因素。侵染时间过短，农杆菌无法充分与种胚细胞接触并完成基因转移；侵染时间过长则可能导致种胚细胞过度损伤。菌液浓度过高可能会对种胚产生毒害作用，影响其生长和转化；菌液浓度过低则会降低转化效率。共培养条件如培养基成分、温度、光照和共培养时间等也需要优化，以促进农杆菌与植物细胞的相互作用和基因整合。

• （3）筛选与再生培养：筛选剂的种类和浓度选择不当可能会导致假阳性或真阳性植株的丢失。再生培养基的配方和培养条件需要根据蓖麻的生长特性进行优化，以提高再生植株的质量和转化效率。

3. 转基因蓖麻的应用前景与安全性考虑

• （1）应用前景：抗草甘膦转基因蓖麻的成功培育为蓖麻种植中的杂草管理提供了有效手段，能够显著提高蓖麻的产量和品质，降低生产成本，增强蓖麻在农业生产中的竞争力。同时，转基因蓖麻也为蓖麻的遗传改良提供了新的途径，可以进一步导入其他有益基因，如抗虫、抗病、耐逆等基因，培育出综合性状优良的蓖麻新品种，满足不同领域对蓖麻产品的需求，推动蓖麻产业的可持续发展。

• （2）安全性考虑：随着转基因作物的推广应用，其安全性问题一直备受关注。对于转基因蓖麻，需要重点考虑其对生态环境和人类健康的潜在影响。在生态环境方面，需要评估转基因蓖麻是否会通过花粉传播等途径将抗草甘膦基因转移到野生近缘种或其他非目标植物中，从而导致杂草抗药性的产生或对生态平衡造成破坏。在人类健康方面，需要研究转基因蓖麻种子及其加工产品中的抗草甘膦蛋白等成分是否会对人体产生过敏、毒性等不良影响。因此，在转基因蓖麻的推广应用过程中，需要建立完善的监测和评估体系，加强安全监管，确保其安全、可持续地应用。