基于在线多中心切割的SCX-SEC- native intact MS 半胱氨酸偶联ADC电荷异构体分析方案

本研究中第一维分离使用ProPac 3R SCX 色谱柱，该色谱柱采用3μm单分散填料，能够对ADC的电荷异构体实现更好分离。CX-1? pH 梯度缓冲液可以建立线性pH梯度，使用方便，重现性好，二者配合使用可在第一维强阳离子交换色谱上对Polivy的电荷异构体实现良好分离 （图2）。

图2. 1D SCX (上) 与 2D SEC （下） UV 谱图，SEC谱图为三个不同馏分（105 μL 1D洗脱液），证明了反冲（黑色）与正冲（粉色）相比，可显著改善2D SEC的峰型并提高其灵敏度。（点击查看大图）

由于一维的SCX缓冲液体系中含有大量与质谱不兼容的缓冲盐，故二维的SEC就显得必不可少，可以在除去一维体系中缓冲盐的同时，使半胱氨酸偶联ADC保持近天然状态，被送入质谱进行在线完整分子量测定。二维色谱的流路连接如图3，第一维分离后的馏分按设置好的时间窗口被依次收集至样品环中，其流路设计确保每个馏分以反冲的方式从样品环中被送入二维色谱柱，可以改善二维SEC的峰型并提高其灵敏度（图2/3）。

图3. 多中心切割2D-LC-HRAM MS 系统流路图，(A) 反冲， (B) 正冲。收集一维馏分的样品环体积为250 μL。（点击查看大图）

在本文的研究中，第一维SCX分离总共鉴定到18个色谱峰（图4），将18个峰按保留时间分为4组，每针进样依次收集一组峰并送至质谱进行在线完整分子量分析，每个峰仅收集一次。得益于Orbitrap质谱的超高灵敏度，即使是相对丰度仅有0.43%的18号峰也可通过单次收集进行高分辨质谱的在线分析。

图4. 1D SCX UV谱图，总共分离并鉴定到了18个色谱峰。下方的表格展示了每个峰的相对丰度及转移至2D SEC的每个馏分的体积。（点击查看大图）

图5展示了8号及9号两个相对丰度最高的峰非变性质谱完整分子量测定的结果。从图中可以发现，8号峰主要以偶联两个药物的相关组分为主，9号峰主要以偶联四个药物的相关组分为主，说明偶联药物数目会对ADC的电荷异质性造成影响。

图5. 图4中8号峰及9号峰的一级质谱图及解卷积结果。左，m/z=5000~7000Da，一级质谱图。中，左图红色阴影区域放大，可见不同组分的质谱峰分布。右，解卷积结果。（点击查看大图）

对质谱结果进一步分析发现，单抗本身的修饰，如重链末端赖氨酸丢失、脱酰胺和氧化等也会对ADC电荷异质性造成影响。以11号峰和12号峰为例，11号峰中主要组分为D2+1Lys与D4+0Lys，12号峰中主要组分为D4+1Lys与D6+0Lys （图6），在其他峰中也可观察到类似的Dn+1Lys与Dn+1+0Lys分布模式，进一步证明了ADC电荷异构体的高度复杂性和使用超高分辨质谱对ADC电荷异构体进行分析的必要性。

图6. 图4中11号峰及12号峰的一级质谱图及解卷积结果。左，m/z=5000~7000Da，一级质谱图。中，左图红色阴影区域放大，可见不同组分的质谱峰分布。右，解卷积结果，可见赖氨酸变体导致的Dn+1Lys与Dn+1+0Lys分布模式。（点击查看大图）

如前文所述，即使是相对丰度只有0.43%的18号峰，得益于质谱平台的高灵敏度，单针进样并分离的18号峰仍然能够得到高信噪比的质谱数据，从而实现蛋白分子量的准确鉴定。如图7所示，该峰中主要包括D4、D6及D6和D8的赖氨酸变体，再次证明了前端分离技术和质谱平台的灵敏度、分辨率及质量精度对痕量ADC电荷异构体鉴定的必要性。

图7. 18号峰的 1D UV谱图（上）及 2D质谱图和解卷积谱图（下）。（点击查看大图）

图8总结了1D SCX分离后各个色谱峰中由质谱所鉴定到的主要组分，可见药物偶联数目及抗体本身的翻译后修饰均会对ADC的电荷异质性产生影响。

图8. 1D SCX分离的各个色谱峰中主要成分汇总（左表）。脱酰胺和氧化多于酸性峰中被鉴定到，赖氨酸变体多见于碱性峰中。随偶联药物数目的增加，ADC在SCX柱上的保留时间也相应增加。（点击查看大图）