3D生物打印人类神经组织：实现功能性神经网络的突破

人脑的复杂性源于多种神经元和胶质细胞的精确连接，形成高度有序的神经网络。理解人类神经网络的运行机制，对于揭示脑健康与疾病至关重要。然而，动物模型难以完全模拟人脑的高级信息处理能力，尤其在神经元组成、突触整合、星形胶质细胞复杂性及网络结构等方面存在显著差异。因此，亟需一种可动态评估人类神经网络功能的可靠体外模型。

近年来，利用人类多能干细胞（hPSCs，包括iPSCs和hESCs）构建三维神经组织成为热点，常见方法包括水凝胶培养、支架培养、自组装脑类器官、脑芯片等。但这些方法在空间结构、细胞分布和功能连接上仍有局限。3D生物打印技术因其可精确控制细胞和水凝胶的空间分布，被认为是构建复杂人类神经组织的理想工具，但软组织（如脑组织）的打印一直面临材料和结构稳定性等挑战。

本研究采用了CELLINK公司的商业化3D生物打印机（包括INKREDIBLE+和BioX型号），作为实现高精度细胞打印的关键工具。CELLINK打印机具备多打印头设计，可同时挤出多种生物墨水和细胞类型，极大提升了组织结构的复杂性和实验灵活性。

• 多打印头协同打印：可同步打印不同类型的神经元和胶质细胞，实现多层、多细胞类型的组织结构。

• 精准控制打印参数：通过调节打印速度、压力和喷嘴直径，保证每层组织厚度和细胞分布的均匀性（如采用27G和30G微喷嘴，分别对应不同层次和细胞密度需求）。

• 支持多种生物墨水：CELLINK打印机兼容多种水凝胶体系（如纤维蛋白、透明质酸、明胶、藻酸盐等），为不同细胞类型的生长和分化提供理想微环境。

• 无菌操作与自动化流程：设备配备紫外消毒功能，保证打印过程的无菌性，适合高通量和标准化实验需求。

通过CELLINK平台，研究团队能够高效、可控地组装人类神经组织，实现了细胞类型、空间结构和功能连接的精确设计。这不仅推动了神经科学基础研究，也为疾病模型和药物筛选提供了强有力的技术支撑。

通过调节纤维蛋白原和凝血酶浓度，确定最佳配比（2.5 mg/mL纤维蛋白原+0.5 U凝血酶），保证细胞在水凝胶中高存活率（6小时后>85%，7天后约80%）。进一步与透明质酸混合，提升打印性和细胞分布均匀性。

hPSC来源的神经前体细胞（NPCs）在水凝胶中分化为成熟神经元，表达MAP2、NeuN等标志物，形成金字塔形态，突起延伸并形成精细树突结构。

免疫染色显示突触标志物（vGlut1、SYN1）在神经元突起上聚集，证实突触生成和网络形成。

• 水平分层打印的“带状”结构，GFP和mCherry标记的细胞层清晰分隔，神经元突起可跨层延伸，形成多层次网络。

• 通过混合皮层谷氨酸能神经元和GABA能中间神经元，模拟大脑皮层的细胞比例（1:4），并证实两类神经元在打印组织中均匀分布，且比例稳定。

• 免疫染色和电生理记录显示，谷氨酸能和GABA能神经元在组织内形成功能性突触连接，表现为自发动作电位和兴奋/抑制性突触电流（EPSCs/IPSCs）

• 在组织中加入hPSC来源的星形胶质细胞前体，三类细胞按设定比例（4:5:1）分布，星形胶质细胞逐渐成熟，分支复杂，与神经元突起紧密交织。

• 通过钙成像和谷氨酸成像，发现星形胶质细胞能响应神经元刺激，表现为钙信号和谷氨酸摄取，证实神经元-胶质细胞间的功能连接。

• 打印皮层神经元与纹状体中型棘状神经元，观察到皮层神经元轴突特异性地投射到纹状体层，模拟大脑皮层-纹状体的真实连接。

• 通过光遗传学和电生理，证实皮层层的刺激可引发纹状体层的钙信号和突触电流，显示跨层功能性连接。

• 以亚历山大病（AxD，GFAP基因突变）为例，打印含病变星形胶质细胞的神经组织，发现病变细胞GFAP聚集、GLT-1表达下降，突触密度减少，钙信号和谷氨酸摄取能力减弱，成功复现疾病相关功能表型。

• 该平台可用于疾病机制研究和药物筛选。

  
  

• 可快速组装多层、功能性人类神经组织，细胞类型和比例可控；

• 支持神经元与胶质细胞的功能连接，便于研究细胞间互作；

• 组织厚度和结构设计合理，适合营养和氧气扩散，易于活细胞成像和电生理检测；

• 可用于疾病建模和药物筛选，具有高通量分析潜力

  
  

• 目前生物墨水较软，难以实现多层垂直打印，组织厚度受限；

• 打印组织缺乏脑类器官的自发结构组织，但保留部分解剖和功能特性；

• 随着生物打印技术进步，未来有望实现更复杂的组织结构和细胞定向排列。

  
  

本研究首次实现了可控组装、功能性连接的人类神经组织3D生物打印，为探索人脑网络运行机制、疾病模型建立和新药筛选提供了全新平台。未来，随着细胞分化技术和生物打印材料的进步，有望构建更复杂的脑区互作模型，推动神经科学、再生医学和个性化治疗的发展。

参考文献：

【1】3D bioprinting of human neural tissues with functional connectivity

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