荧光定量PCR技术

Real-Time PCR 技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，Z后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。下面就让小编带你了解一下荧光定量PCR技术。

和普通PCR的差异

荧光定量PCR技术，然而，实际上，PCR扩增曲线是S形曲线，而不是不是标准的指数曲线。

这是由于扩增规模随着PCR循环的增多而迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不能达到要求，从而导致PCR的效率越来越低，产物增长的速度也越来越低。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种复杂环境因素的相互作用，难以精确控制不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低。因此，即使是多次PCR重复实验，，拥有基本一致的各种条件，也会得到大不相同的各种结果。因此，起始DNA拷贝数不能够按照Z终PCR产物的量直接计算出来。

荧光定量PCR的方法

荧光定量PCR使用荧光探针和荧光染料两种荧光化学，荧光定量 PCR 的方法也有特异类和非特异类两类。在PCR反应中，产物通过利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测，称为特异性检测方法。在PCR反应体系中，将过量荧光染料加入，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。叫做非特异性检测方法。第二种方法更容易实行，然而diyi种方法增加了探针的识别步骤，具有更高的特异性。

特异性Taqman水解探针法

Taqman荧光探针是Taqman荧光定量技术的基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，淬灭基团吸收发射基团发射的荧光信号。

当PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性酶切降解了探针，分离了荧光发射基团和荧光淬灭基团，从而使得荧光监测系统可接收到荧光信号，也就是说，每当有一条DNA链被扩增，就会形成一个荧光分子，使荧光信号的累积与PCR产物的完全同步得以实现，从而实现定量，FAM, TET, VIC, HEX为常用的荧光基团。

非特异性SYBR Green I染料法

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出的荧光微弱，然而一旦和双链DNA结合后，大大增强了荧光效果。所以，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量有密切的关系，PCR体系存在的双链DNA数量可以根据荧光信号检测出来。