应用EZsepHMR-Lipid固相萃取柱建立鱼肉中水杨酸残留量的检测方法

水杨酸，分子式为C₇H₆O₃，是植物柳树皮提取物，是一种天然的消炎药。水杨酸可以杀菌、消炎，从而常被用于对水产动物体表的水霉、鳃霉的剥离分解及伤口修复，水产动物因红斑、皮肤病、打印、赤皮、烂尾、溃烂、腐皮、肤霉、脱粘、白头白嘴、烂鳃、水肿、出血等引起的多种伤口能快速愈合。本品定期使用能有效预防和降低水产品发病率并快速净化水体，从而抑制降解水体中的各种杂菌及病原体，但长期过量使用会造成药物在动物体内富集，人类食用这些水产品会使残留的兽药进入人体，从而影响人体健康。

本文参照《鱼可食性组织中水杨酸残留量的测定 液相色谱-串联质谱法(征求意见稿)》，利用EZsep?HRM-Lipid固相萃取柱（300mg/6mL，货号：PZ12624） 净化样品，再通过高效液相色谱串联质谱检测进行检测，建立了鱼肉中水杨酸残留量的分析方法。

关键词：

水杨酸，固相萃取

1.1 仪器与试剂

MPREP-SPE08手动固相萃取装置，货号：PZ0008，北京莱伯帕兹检测科技有限公司；

E.T.氮吹浓缩仪，货号：C020017，北京莱伯帕兹检测科技有限公司；

4500质谱系统，SCIEX公司；

EZsep?HRM-Lipid固相萃取柱（300 mg/6mL，货号：PZ12624），北京莱伯帕兹检测科技有限公司；

冷冻离心机，GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂；

乙腈（色谱纯），购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

甲酸（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 工作液配制

水杨酸标准物质：100mg/瓶，购自坛墨质检标准物质中心。

水杨酸标准储备液：取水杨酸标准品适量(相当于有效成分约10mg)，精密称定，用乙腈稀释至10mL容量瓶中，配制成浓度为1000μg/mL的水杨酸标准储备液。

水杨酸D4标准储备液：浓度为100μg/mL溶剂为甲醇，购自上海安谱实验科技股份有限公司。

水杨酸标准中间液：移取水杨酸标准储备液0.1mL，用乙腈稀释至10mL容量瓶中，配制成浓度为10μg/mL的水杨酸标准中间液。

水杨酸标准使用液：水杨酸标准中间液1.0mL，用乙腈稀释至10mL容量瓶中，配制成浓度为1.0μg/mL的水杨酸标准使用液。

水杨酸D4标准使用液:移取水杨酸标准储备液0.1mL，用乙腈稀释至10mL容量瓶中，配制成浓度为1.0μg/mL的水杨酸D4标准使用液。

依次移取1.0μg/mL的水杨酸标准使用液0、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0mL，分别置于10mL容量瓶中并均加入水杨酸D4标准使用液0.2mL，以0.1%甲酸水溶液定容至刻度，得到浓度依次为0μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L的标准系列工作液，水杨酸D4浓度固定为20μg/L。

1.3 实验部分

1.3.1 样品制备

取鱼肉试样2g，置于50mL聚丙烯离心管中，添加水杨酸D4标准工作液40μL，加5%甲酸乙腈溶液10.0mL，涡旋混匀1min超声提取10min，10000r/min冷冻离心5min，收集上清液5.0mL待净化。

1.3.2 固相萃取净化

EZsep?HRM-Lipid固相萃取柱（300 mg/6mL，货号：PZ12624）用5mL乙腈进行活化，取1.3.1待净化液上样，收集流出液，以E.T.氮吹浓缩仪，40℃氮气浓缩至近干，加1.0mL0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀过微孔滤膜后供LC-MS/MS测定。

1.3.3 LC-MS/MS仪器条件

色谱柱：Shim-pack Velox C18（2.7μm，2.1*100mm）；

检测方式：多反应监测（MRM）；

流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈；

流速：0.3mL/min。

表1 流动相梯度洗脱表

表2 加标回收率

图1 标液色谱图

图2 空白样品色谱图

图3 10μg/kg样品添加色谱图

本实验使用EZsep?HRM-Lipid固相萃取柱（300mg/6mL，货号：PZ12624） 对鱼肉样品进行净化，通过高效液相色谱串联质谱测定其中的水杨酸残留量，该方法的加标回收率在95.0%~105.3%之间，RSD为3.8%，满足标准要求。测试结果说明EZsep?HRM-Lipid固相萃取柱（300 mg/6mL，货号：PZ12624）能很好的完成方法中的净化工作，并且结果稳定、可靠。

[1] 《鱼可食性组织中水杨酸残留量的测定 液相色谱-串联质谱法(征求意见稿)》