JACS, IF 15.6 | 用于多重RNA成像的生物发光探针

概述

RNA分子的亚细胞定位和动态变化与多种生命活动密切相关。然而，在活细胞中同时追踪多个RNA分子仍面临技术挑战。近日，加州大学尔湾分校的 Jennifer A. Prescher 和 Andrej Lupták 教授团队在《美国化学会志》（JACS）发表研究，报道了一套基于生物发光的“RNA灯笼”系统。该系统利用正交的RNA结合蛋白和分裂萤光素酶技术，实现了多靶点 RNA 的高分辨率成像，为RNA生物学研究提供了新的工具。

一、研究背景

传统RNA成像的主流技术荧光成像，因依赖外部激发光，易造成细胞光毒性、荧光分子光漂白，且所需大尺寸适配子标签会干扰RNA正常功能；而原位杂交技术仅能检测固定细胞，只能获取RNA分布静态信息，无法捕捉其动态变化过程。

生物发光成像通过荧光素酶催化荧光素的氧化反应产生光，无需任何外部激发光，从根源上避免了光毒性和光漂白；同时，生物发光的背景噪声极低，几乎没有细胞自发发光的干扰，信噪比远高于荧光成像。它兼顾了活细胞连续成像、多靶点同时检测和无干扰低背景的要求。

该研究将此前开发出来的第一代 RNA lanterns 生物发光探针升级为多靶点、多色的正交化、模块化生物发光成像平台，实现了活细胞中多个 RNA 靶点的特异性检测和同时动态分析。

二、核心设计：三组正交化探针构建多色生物发光成像系统

研究人员基于分裂型NanoLuc萤光素酶（NanoBiT）构建了“RNA灯笼”系统。该系统将萤光素酶分为两个无活性的片段：LgBiT和SmBiT。只有当两个片段在空间上靠近时，才能重新组装为有活性的全酶并产生生物发光。

为实现RNA特异性成像，研究团队将SmBiT与MS2外壳蛋白（MCP）融合，将LgBiT与其他RNA结合蛋白融合。同时，在目标RNA上引入结构化的RNA标签，该标签包含MS2适配体和另一个正交适配体。当目标RNA表达时，两个融合蛋白分别结合至RNA标签的对应位置，使LgBiT和SmBiT相互靠近，产生生物发光信号。

图表 1. 用于多重RNA检测的生物发光平台。（A）用于多转录本成像的RNA灯笼策略示意图。MS2外壳蛋白（MCP）和一个正交RNA结合蛋白（RBP）分别与NanoBiT片段（SmBiT和LgBiT）连接。通过将荧光蛋白（FP）与LgBiT融合，实现了多色发射。RNA灯笼使用PP7外壳蛋白（PCP）、噬菌体HK022 Nun蛋白（Nun）以及古菌核糖体蛋白L7Ae（L7Ae）进行设计。当灯笼与含有MS2及PP7、boxB或k-turn基序的刚性化RNA标签结合时，发生NanoBiT互补。（B）MCP-Nun RNA灯笼（左）和MCP-L7Ae RNA灯笼（右）的结构模型。使用PyMOL对结构进行排列，包括MCP（紫色，PDB ID: 1ZDI）、Nun或L7Ae（黄色，分别为PDB ID: 1HJI和1RLG）、NanoLuc（PDB ID: 5IBO）（其中LgBiT以青色表示，SmBiT以深蓝色表示）以及一个荧光蛋白（灰色，PDB ID: 5LK4）。

图表 2. 正交RNA灯笼的初步评估。（A）一组三色正交RNA灯笼的示意图。一个NanoBiT MCP-PCP灯笼结合MS2-PP7，一个VenusΔC12融合的MCP-Nun灯笼结合MS2-boxB，一个mScarlet-I融合的MCP-L7Ae灯笼结合MS2-k-turn。（B）MCP-Nun和MCP-L7Ae RNA灯笼与先前验证过的MCP-PCP灯笼相比的初步测试。每种探针在HEK293T细胞裂解液中表达，并外源加入不同浓度（0.1?10 nM）的包含其对应适配体（MS2与PP7、boxB或CS2）的刚性化RNA标签。图中绘制了相对于无RNA对照的总发光强度倍比变化。误差线表示n=3次重复实验的标准误。（C）归一化的RNA灯笼发射光谱。在表达每种灯笼的HEK293T细胞裂解液混合物中，加入正交RNA标签（MS2-PP7和MS2-boxB标签为1 nM，MS2-CS2标签为100 pM）后，检测到不同的发射光谱。归一化光谱代表n=6次重复实验的平均值。振幅变异小于线宽。

三、RNA 标签的结构优化

在初步评估中，新构建的MCP-Nun和MCP-L7Ae系统信号强度低于原有的MCP-PCP系统。研究人员推测，这可能与荧光蛋白的引入增加了系统体积有关，需要调整RNA标签的结构以优化LgBiT和SmBiT的空间排列。

研究团队合成了一系列RNA标签变体，系统性地改变MS2适配体与第二个适配体之间的间隔长度和相位角度。实验结果显示，对于MCP-Nun系统，当间隔为29个核苷酸（M-29-B）时，体外信号增强倍数达到约220倍。对于MCP-L7Ae系统，间隔为35个核苷酸（M-35-C）时取得最佳信号，增强倍数超过100倍。

值得注意的是，较长间隔的RNA标签在活细胞中表现不佳，可能与其稳定性降低或降解速率增加有关。因此，研究人员选择了较短的M-7-B和M-7-C标签进行后续的细胞实验。这些优化后的RNA标签保持了良好的正交性，仅与对应的结合蛋白产生信号，与其他系统无交叉反应。

图表 3. RNA标签优化。（A）MCP-Nun和（B）MCP-L7Ae RNA灯笼在HEK293T细胞裂解液中表达时，在一系列结构设计下的相对生物发光（A图为1 nM，B图为100 pM）。不同间隔长度（各柱下方以蓝色突出显示）调节了适配体之间的距离和相位角。相对发光强度表示占最大信号的百分比，其中最高平均值设为100%。（C）在不同浓度RNA标签（0?100 nM）下，RNA灯笼的正交性。灯笼在HEK293T细胞裂解液中表达，向每种灯笼外源加入RNA标签（M-7-P/B/C）。相对发光强度表示每种探针产生信号占最大信号的百分比，各彩色柱代表加入不同的正交RNA标签。误差线表示标准误，（A、B）图为n=9个样本（来自三个生物学重复实验，每个实验包含三个技术重复），（C）图为n=3个样本。

四、活细胞验证：实现亚细胞分辨率的多靶点 RNA 成像

研究团队通过两步实验，在活细胞中验证了该系统的多重 RNA 成像能力，实现了单细胞水平、亚细胞分辨率的多靶点 RNA 检测。

图表 4. 活细胞中模型转录本的多重生物发光成像。（A）编码荧光蛋白并在3′非翻译区包含结构化RNA标签的mRNA示意图。TagRFP657（RFP）序列在3′区域引入M-7-B或M-3-P编码。RFP-M-7-B的转录导致MCP-Nun灯笼组装（黄色），RFP-M-3-P的转录导致MCP-PCP灯笼组装（暗红色）。（B）稳定表达各灯笼的HEK293T细胞共培养成像。细胞未转染（? RNA），或瞬时转染编码RFP-M-7-B、RFP-M-3-P或两者（+ 所示标签）的DNA。RFP荧光（红色，左列）验证了mRNA的表达。MCP-Nun和MCP-PCP探针荧光（分别为黄色和品红色通道）指示RNA灯笼的表达。在相应RNA标签存在下，灯笼互补产生发光信号（灰色）。在M-7-B存在下，100%的发光细胞表现出靶向信号（MCP-Nun，15/15）。在M-3-P靶向RNA结构存在下，81%（22/27）的发光细胞表现出靶向信号（MCP-PCP）。两种RNA同时加入时，表达任一RNA灯笼的细胞均产生信号（12/30发光细胞表达MCP-Nun灯笼，18/30表达MCP-PCP灯笼）。比例尺 = 20 μm。

图表 5. 活细胞中生物学多样性转录本的多重成像。（A）两种标记的目标转录本（mCherry-β-肌动蛋白3′非翻译区杂合mRNA和NEAT1非蛋白编码RNA）的示意图。编码任一转录本的DNA均经过改造，在3′区域引入结构化RNA标签。预计mRNA定位于细胞质，而非蛋白编码RNA定位于细胞核。（B）同时表达两种RNA灯笼和目标转录本的细胞代表性图像。稳定表达MCP-Nun灯笼的HEK293T细胞瞬时转染表达MCP-PCP灯笼的DNA以及标记的RNA。NEAT1-M-7-B引导MCP-Nun灯笼在细胞核内发生互补（绿色），而mCherry-β-肌动蛋白3′非翻译区-M-3-P引导MCP-PCP灯笼在细胞质中发生互补（蓝色）。明场图像和Hoechst核染色作为亚细胞定位的参照。相位子彩色图像是由发光强度（以任意单位计）与通过生物发光相位子分析获得的MCP-Nun（绿色）和MCP-PCP（蓝色）探针掩膜叠加合成的。相位子彩色图像证实了NEAT1-M-7-B的核定位和mCherry-β-肌动蛋白3′非翻译区-M-3-P的胞质定位。细胞3和细胞4展示了同一细胞内的多重RNA成像。比例尺 = 20 μm。

五、技术特点与应用前景

本研究报道的 RNA 灯笼系统具有以下特点：第一，采用生物发光原理，无需外部光源激发，避免了光毒性和光漂白问题；第二，通过正交RNA结合蛋白和BRET技术实现多重成像，可同时追踪多种RNA分子；第三，RNA标签长度较短（65-83个核苷酸），对目标RNA的潜在干扰较小；第四，系统具有模块化特征，可扩展至更多正交蛋白-适配体组合。

该系统的局限性包括：RNA标签可能对目标RNA的稳定性产生一定影响；信号强度与RNA表达水平之间的关系受多种因素调控，需要优化各组分表达水平；应用于内源性RNA成像时需要进行基因组编辑，引入标签序列。

总体而言，这套生物发光RNA成像系统为研究活细胞中RNA的定位、运输和相互作用提供了新的技术手段。随着进一步优化，该系统有望在发育生物学、神经科学和疾病研究等领域发挥作用。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16597