新药研究 | 核酸抗体偶联药物(AOC)的表征分析

小核酸药物行业发展迅速，至今已有15款药物获批，成为继小分子和抗体药物后的第三波创新药浪潮。然而受限于递送手段的限制，目前已上市的小核酸药物仅能针对肝脏靶点。小核酸抗体偶联药物（Antibody-oligonucleotide conjugates，AOC）利用抗体将治疗性寡核苷酸递送至特定细胞或组织，将抗体的组织特异性优势，与小核酸的靶点特异性优势相结合，拓展了寡核苷酸药物的组织/细胞靶向性。近年来，诸多公司将注意力和资源集中在开发基于AOC技术的先进药物上，2021年11月，AOC先驱Avidity Biosciences公司的小核酸抗体偶联物AOC1001的I期临床试验完成首例患者给药，标志着全球首款AOC药物进入临床试验。

AOC药物作为具有巨大潜力的新型生物药物，其药物质量的控制对于安全性和有效性至关重要。一方面，每个部分包括抗体的纯度、特异性、亲和力等，小核酸的纯度、稳定性，连接子的稳定性、细胞毒性等需要检测；另一方面，完整AOC药物本身的质量包括抗体和小核酸的偶联比例、游离抗体、游离小核酸的比例等都需要严格监测。

本实验使用的样品为一种单抗偶联寡核苷酸的AOC药物，浓度为40 mg/mL。IgG的理论分子量为147244 Da，寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)的理论分子量为6581Da，与IgG连接前需先对ODN进行修饰，将ODN的5`-端磷酸骨架与HS-C6结构反应，形成HS-C6修饰的ODN(分子量6777Da)。

IgG和ODN的连接方式为Sulfo-SMCC偶联方式，偶联过程见图2，整个偶联过程分为两步，第一步IgG的游离-NH₂与SMCC反应形成马来酰亚胺激活抗体(maleimide-activated IgG)，之后再与连接在HS-C6的ODN反应，得到最终的偶联产物。

在CZE条件下可有效分离游离IgG，AOC及游离ODN分子。标准品和样品的分离结果见图3。

在CZE中，样品的分离基于分子在电场作用下荷质比的差异。在碱性缓冲液条件下，由于样品中的IgG、ODN以及AOC都带负电荷，在正电场下荷质比越大的分子迁移速度越慢。荷质比主要由电荷数和分子量决定，游离IgG分子量最大，带的负电荷数量比较少，荷质比小，因此会最先出峰。游离ODN由于分子量最小，电荷数最高，因此荷质比最大，会最后出峰。对于AOC来说，其分子量与IgG相比变化不大，而电荷数随着ODN的偶联而增大，因此迁移速度会慢于IgG，且偶联的OND数目越多，电荷增加越多，迁移速度越慢。迁移时间顺序为，IgG < IgG-(n)ODN<odn< span="">。在本次实验中，IgG标准品的迁移时间在6.25 min，ODN标准品的迁移时间在20.95 min，与上述理论推导出峰顺序一致。

为了验证CZE中推断的峰2、3、4是否为IgG偶联了不同数量ODN的峰，并确认偶联的数量，我们尝试了HRMS的方法。通过HRMS分别检测了IgG标准品和AOC样品， MS结果见图4。在SCIEX OS软件中对IgG标准品TOF MS图谱进行解卷积，确认IgG的分子量为147244.2Da，在AOC样品TOF MS图谱的解卷积结果中也检测到分子量为147246.3Da的一簇峰，推断是游离IgG的峰，与IgG标准品相比多的2Da可能是由于AOC样品异质性较强导致的解卷积后分子量差异。在AOC解卷积图谱中还检测到比游离IgG分子量多6994.6Da, 13987.8Da以及20847.4Da的峰，鉴定为IgG连接1个ODN(IgG-1ODN)，2个ODN(IgG-2ODN)和3个ODN(IgG-3ODN)的峰。增加的6994.6Da为IgG上连接了SMCC linker及HS-C6修饰的ODN分子产生的分子量。

进一步将原始数据上传至SCIEX Biologics Explorer软件进行完整分子量分析，计算IgG，IgG-1ODN，IgG-2ODN及IgG-3ODN各峰的峰面积见图5(Volume)，通过峰面积计算各峰的比例分别为32.90%，44.54%，20.52%及2.03%。

CZE与HRMS两种结果计算的各组分比例比较如表2。从表2可以看出，CZE和HRMS两种技术计算的不同组分的比例比较一致。