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分子杂交(molecular hybridization)是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下末端标记DNA的方法。
现在将Klenow片段标记3'末端当作离子来对末端标记的方法进行说明。
注意事项:
1.还有一些其他的方法能够用作末端标记。
2.对于DNA的纯度不作严格的要求,即使制备的质粒的数量很少,也能够进行末端标记来使得探针合成。
操作准备:
试剂:10×末端标记缓冲液,Klenow片段,[α-32P] dNTP,合适的限制酶以及200mmol/L 3种不含标记的dNTP。
设备:水浴锅,高速台式离心机等。
材料:待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。
操作步骤:
在25μl反应体系中通过合适的限制酶对1μg的DNA进行酶切。将1mg已酶切的DNA、5ml 2mmol/L10×末端标记缓冲液以及1ml 3种dNTP和适量的[a-32P]-dNTP加水变成50ml溶液混合均匀。将1单位的Klenow片段加入,在室温环境下反应30min。将1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液加入,在室温环境下保温15min。加热到70℃保温5min,使反应终止。用酚/氯仿抽提后,用Sephdadex G-50柱层析或者用乙醇沉淀来使标记的DNA分离。
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