以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针的方法

分子杂交（molecular hybridization）是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针的方法。

概念：

对cDNA文库中相应的基因进行分离是cDNA单链探针的主要作用。RNA为模板通过可用随机引物或者用寡聚dT为引物两种方式来使得cDNA探针合成。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链通过碱变性后，使得RNA单链被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析就能够使单链探针获得。

合成cDNA探针方法：

RNA为模板能够通过以下两种引物来合成cDNA探针。

1.可用随机引物合成cDNA探针

这种方法使得用寡聚dT为引物合成cDNA探针的缺陷得以避免，能够使产生的探针具有比较高的比活性。然而，因为一般会有很多不一样的RNA分子包含于模板RNA中，和通过克隆DNA为模板所得的探针想比较，其所得的探针具有复杂的多的序列，因此，必须尽可能地对mRNA中的目的序列预先富集。

2.用寡聚dT为引物合成cDNA探针

仅仅在带Poly(A)的mRNA的时候被使用，而且产生的探针对于mRNA 3'末端序列有极大的偏向。

操作准备：

试剂 ：RNasin；10% SDS；0.5mol/L EDTA (pH8.0)；1mol/L KCl；250mmol/L MgCl2；100mmol/L DTT；反转录酶；[a-32P]dCTP；5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP以及适合的引物。

设备：恒温水浴锅，高速台式离心机等。

材料：已经提纯的RNA或mRNA

操作步骤：

将Rnasin 20U，2.0ml 0.1mol/L DTT，10.0ml [a-32P]dCTP，10.0ml 5mmol/L dNTP,2.0ml 250mmol/L MgCl2,3.5ml 1mol/L KCl,2.5ml1mol/L Tris·Cl(pH7.6),10.0ml合适的产物以及10.0mlRNA或mRNA 加入到已置于冰浴中的灭菌离心管中，加水变成48ml的溶液，将2ml反转录酶加入到溶液中，混合均匀后稍稍离心，在37℃温度下保温2h。在反应完成后将2ml的10% SDS以及2ml 的0.5mol/L EDTA (pH8.0)加入，再将3ml 3mol/L NaOH加入其中，加热到68℃保温半个小时来使得RNA被水解。冷却到室内温度，将10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)加入混合均匀，然后再将3ml 2mol/L HCl加入。酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法来使标记的探针分离。

注意事项

RNA非常容易降解，所以必须在DEPC处对实验中的所有试剂和器皿进行处理，灭菌备用。