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分子杂交(molecular hybridization)是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下Southern杂交方法。
流程
制备待测核酸样品
1.将细胞破碎或者裂解
2.对基因组DNA进行抽取纯化
3.利用限制酶将DNA消解为大小不一的DNA片段
电泳分离待测DNA样品
能够通过核素标记所用的分子量标准,杂交后的标准分子量DNA亦可以显影出条带
凝胶中核酸变性
如果DNA片段的分子量高于10kb,那么需要的转移时间将会很长。因此,必须控制DNA片段的Z长长度小于2kb。
若靶序列在5kb以上,那么需要进行脱嘌呤处理。
脱嘌呤处理步骤:
在0.25mol/L HCl中浸没入凝胶,在室温环境下轻微地摇晃,一直到溴酚蓝的颜色变为黄色为止。然后再将凝胶在灭菌双蒸水中浸没。
若靶序列在5kb以下,那么直接进行如下步骤
1.在变性液中浸没凝胶,在室温环境下30min,轻微地摇晃,再将凝胶在灭菌双蒸水中浸没,在中和液中浸没凝胶,在室温环境下30min,Z后在20?SSC中使凝胶平衡不少于10min。
Southern印迹
在高盐条件下,利用毛吸作用使得凝胶中的DNA向硝酸纤维素滤膜转移,在烘干固定之后就能够用来杂交,该方法是Southern发明,所以,又被叫做Southern印迹。
转移方法:
1.电转法
2.真空转移法
3.毛细管虹吸印迹法
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