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对特定的DNA片段起到放大扩增作用的一种分子生物学技术,被称为聚合酶链式反应。其可以被当作生物体外的特殊DNA复制,能够大幅增加微量的DNA。1971年Khorana首先提出设想,1985年Mullis发明了聚合酶链反应。下面就让小编带你了解一下PCR反应阴性的原因。
值得注意的是,有有时候会忘记将Taq酶或溴乙锭加入。
物理原因:
对于PCR扩增而言,变性可谓非常的重要,如果变性的时间很短并且变性的温度很低,那么很有可能导致假阴性的出现。退火事有过低的温度,可能会造成非特异性扩增,从而使得特异性扩增效率降低。如果退火温度过高,那么会对引物与模板的结合产生影响从而使得PCR扩增效率降低。有些时候,扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度也非常有必要使用标准的温度计检测一下,因为这些也很有可能造成PCR失败。
反应体积的改变:
20ul、30ul、50ul、或100ul为进行PCR扩增时常用的体积。科研和临床检测的不同目的决定了应用多大体积进行PCR扩增。如果在做小体积如20ul后,又做大体积,必须先对条件进行摸索,否则非常容易失败。
Mg2+浓度:
PCR扩增效率受到Mg2+离子浓度非常大的影响,如果Mg2+浓度过高,就会使得PCR扩增的特异性降低,如果Mg2+浓度过低,那么可能会对PCR扩增产量产生影响甚至会导致PCR扩增失败,扩增条带没有出现。
引物:
PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散通常是由引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称造成的。若引物合成质量出现问题,两条引物一条浓度低,另外一条浓度高,导致扩增效率低下以及扩增不均匀,那么有如下方法。
1.对一个好的引物合成单位进行选定。
2.引物的浓度不但要注意OD值而且要注意引物原液做琼脂糖凝胶电泳,必须要出现引物条带,并且两引物带需要有大体相同的亮度,如果一条引物没有条带,另外一条引物有条带,那么这个时候做PCR有失败的可能性。如果一条引物亮度低,另外一条引物亮度高,那么在稀释引物时需要对其浓度进行平衡。
3.当对引物进行保存时,应该高浓度少量分装保存,避免长期放冰箱冷藏部分或者多次冻融,造成引物变质,降解失效。
4.引物没有得到合理的设计,若引物没有足够的长度,那么二聚体等会在引物之间形成。
靶序列变异:
如果靶序列发生突变或缺失,那么会对引物与模板特异性结合产生影响,导致靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,从而造成PCR扩增失败
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