透射电镜样品制备过程

　　透射电镜是一种综合性大型分析仪器，在现代科学技术的研究开发工作中被广泛地使用。由于透射电镜能观察的样品必须很薄(60～70nm)，所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一。一般有以下两种方法：

负染色技术

　　负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。

　　样品要求：①透射电镜样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和透射电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在透射电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。

　　操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于透射电镜观察。

超薄切片技术

　　超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构Z常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。

　　具体操作步骤、注意事项如下：

　　1、取材和前固定：

　　快速的切取大小为0.5~1.0mm3的样品块，一分钟内把组织(样品)块浸入2.5%戊二醛溶液，每个离心管内装20以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。②所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15min，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底。③细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。④泡在前固定液的材料Z多可以放2周。

　　2、漂洗：冲洗3次，每次15min。

　　3、后固定：加入1%锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5h，真菌、细菌一般处理2h，动物样品处理1h。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。

　　4、漂洗：冲洗3次，每次15min。

　　5、脱水：室温下，丙酮30%-50%-70%-80%-90%每级作用30min，纯丙酮在作用3次，每次作用30min。

　　6、渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他透射电镜样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。

　　7、包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12h，60℃聚合36～48h。

　　8、超薄切片：超薄切片的切片面积Zda不能超过0.5mm×0.3mm，比较难切的植物样品要求切片面积更小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片，却是一件不容易的工作。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等，前期准备工作至少需要半天时间。超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作，需要静下心来慢慢操作，切好一个透射电镜样品至少需要1小时。

　　9、正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此透射电镜生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前Z常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。