GX液相色谱仪结构

　　GX液相色谱仪一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。

一、输液泵

　　1、泵的构造和性能

　　输液泵是GX液相色谱仪中Z重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应<0.5%，这对定性定量的准确性至关重要;②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min;③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2;④液缸容积小;⑤密封性能好，耐腐蚀。

　　GX液相色谱仪泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定;螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用Z多的是柱塞往复泵。

　　柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响;泵压可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%)，但出故障的机会较多(因多一单向阀)，价格也较贵。

　　2、泵的使用和维护注意事项

　　为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

　　①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相Z好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜(0.2µm或0.45µm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

　　②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水)。

　　③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，Z终产生漏液。

　　④输液泵的工作压力决不要超过规定的Zgao压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

　　⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

　　3、梯度洗脱

　　GX液相色谱仪有等强度和梯度洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

　　梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。

　　两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度Z常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

　　在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

　　①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

　　②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

　　③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的Zda压力。

　　④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

二、进样器

　　早期GX液相色谱仪使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证ZX进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。GX液相色谱仪进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

　　1、隔膜进样：

　　用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的ZX，死体积几乎等于零，可以获得Z佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1~2%;加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。

　　2、停流进样：

　　可避免在高压下进样。但在GX液相色谱仪中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”;另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

　　3、阀进样：

　　一般GX液相色谱仪分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样(约下降5~10%左右)，但耐高压(35~40MPa)，进样量准确，重复性好(0.5%)，操作方便。

　　六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%(Z多75%)，并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5~10倍(Z少3倍)，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

　　六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的Zda压力;再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

　　4、自动进样：

　　用于大量样品的常规分析。

三、色谱柱

　　色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。用于GX液相色谱仪的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3、5、7、10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析，只要500即可;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

　　柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到Z佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使Z好的装填技术，在柱ZX部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

　　1、柱的构造

　　色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。

　　色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱(常量柱)，内径2~5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm)，柱长10~30cm;②窄径柱(narrowbore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn)，内径1~2mm，柱长10~20cm;③毛细管柱(又称微柱microcolumn)，内径0.2~0.5mm;④半制备柱，内径>5mm;⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm;⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

　　2、柱的发展方向

　　因强调分析速度而发展出短柱，柱长3~10cm，填料粒径2~3µm。为提高分析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是：①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱达到高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于实现LC-MS联用。

　　但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)，更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1~100µl/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。

　　3、柱的填充和性能评价

　　色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20µm时，干法填充制备柱较为合适;颗粒<20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法，WatersZL;③轴向加压法，主要用于装填大直径柱;④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。

　　必须指出，GX液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。

　　无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。

　　一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

四、检测器

　　检测器是GX液相色谱仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。GX液相色谱仪的检测器要求灵敏度高、噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好和适用范围广。

　　1、分类

　　①按原理可分为光学检测器(如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射)、热学检测器(如吸附热)、电化学检测器(如极谱、库仑、安培)、电学检测器(电导、介电常数、压电石英频率)、放射性检测器(闪烁计数、电子捕获、氦离子化)以及氢火焰离子化检测器。

　　②按测量性质可分为通用型和专属型(又称选择性)。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。

　　③按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。

　　④检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。

　　2、性能指标

　　①噪音和漂移：在GX液相色谱仪稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。

　　②灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·ml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g。

　　③检测限：检测器灵敏度的高低，并不等于它检测Z小样品量或Zdi样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。

　　检测限指恰好产生可辨别的信号(通常用2倍或3倍噪音表示)时进入检测器的某组分的量(对浓度型检测器指在流动相中的浓度——注意与分析方法检测限的区别，单位g/ml或mg/ml;对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量，单位g/s或mg/s)。又称为敏感度。D=2N/S，式中N为噪声，S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。

　　检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。值得注意的是，分析方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外，还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。

　　④线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，Zda与Z小进样量(浓度型检测器为组分在流动相中的浓度)之比。也可用响应信号的Zda与Z小的范围表示。

　　定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量Z好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A=BCx，B为响应因子，当x=1时，为线性响应。对大多数检测器来说，x只在一定范围内才接近于1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。

　　线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。

　　⑤池体积：除制备色谱外，大多数GX液相色谱仪检测器的池体积都小于10µl。在使用细管径柱时，池体积应减少到1~2µl甚至更低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。

　　3、紫外检测器

　　UV检测器是GX液相色谱仪中应用Z广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度(实际是提高检测限)。此外，梯度洗脱时，还会产生漂移。

　　注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A=1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。

　　UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器。按光路系统来分，UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长(单通道)检测器和双波长(双通道)检测器。PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性(确证是否是单一纯物质)，色谱用于定量。常用于复杂样品(如生物样品、中草药)的定性定量分析。

五、数据处理和计算机控制系统

　　早期的GX液相色谱仪是用记录仪记录检测信号，再手工测量计算。其后，使用积分仪计算并打印出峰高、峰面积和保留时间等参数。80年代后，计算机技术的广泛应用使GX液相色谱仪操作更加快速、简便、准确、精密和自动化，现在已可在互联网上远程处理数据。计算机的用途包括三个方面：①采集、处理和分析数据;②控制仪器;③色谱系统优化和专家系统。

六、恒温装置

　　在GX液相色谱仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。

　　温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说，温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其分配系数K，但对分离选择性影响不大;还可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡。

　　色谱柱的不同工作温度对保留时间、相对保留时间都有影响。在凝胶色谱中使用软填料时温度会引起填料结构的变化，对分离有影响;但如使用硬质填料则影响不大。

　　总的说来，在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中，温度对分离的影响并不显著，通常实验在室温下进行操作。在液固色谱中有时将极性物质(如缓冲剂)加入流动相中以调节其分配系数，这时温度对保留值的影响很大。

　　不同的检测器对温度的敏感度不一样。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时，就会造成基线漂移起伏。示差折光检测器的灵敏度和Z小检出量常取决于温度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附热检测器也要求在±0.001℃以内。