寡核苷酸纯化工艺

作为极具前景的治 疗药物，寡核苷酸已成为全 球研发和投资的重 点领域。寡核苷酸受到合成反应效率和原料纯度等多重因素的影响，在合成过程中会产生多种不同的杂质。反相色谱、离子交换等是对寡核苷酸粗品纯化的常用色谱手段。

寡核苷酸纯化工艺，需要充分考虑产品纯度和回收率之前的平衡，有效的纯化放大策略有利于工艺开发和制备放大的顺利进行。下图 1 展示了典型纯化工作流程。

图 1. 采用安捷伦自动纯化软件实现自动化纯化工作流程

安捷伦针对寡核苷酸制备，主要工作流程包括：

1、在分析柱上，进行目标化合物确认和分析方法筛选；

2、将分析数据导入到自动纯化软件中，指定目标化合物并生成“聚焦”制备梯度；

3、在制备柱上进行纯化；

4、自动纯化软件将需要分析的馏分自动生成序列表，以进行馏分分析和纯度确认。

寡核苷酸分析到纯化实例

本实例采用了安捷伦 1290 Infinity II 自动放大 LC/MSD 系统。该系统具有以下特性：

图 2. 安捷伦 1290 Infinity II 自动放大 LC/MSD 系统

（点击图片查看产品详情）

• 在一套系统上实现从分析到制备的放大，提高制备通量

• 自动馏分延迟传感器技术，以及极低的峰扩散和交叉污染，提高馏分的纯度和回收率

• 自动纯化软件使工作流程能够从分析自动放大至制备，无需进行方法开发

对于寡核苷酸纯化，安捷伦 AdvanceBio 寡核苷酸系列色谱柱是首 选。这类柱子使用了 Agilent InfinityLab Poroshell 技术，并且键合了高 pH（HPH）键合相。不仅能在较高 pH 和温度下使用，每批 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱还会进行严格质量控制，以实现 n/ (n–1) 寡核苷酸分离。本实例使用色谱柱：

分析柱

Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18, 3 × 100 mm，2.7 µm（货号 695975-502）

制备柱

Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱，21.2 × 150 mm，4 µm（货号 671150-702）

本实例样品

浓度 3.1 mmol/L，溶于 20 mmol/L PBS 中的寡核苷酸样品。

本实例工作流程

1、在分析柱上，进行目标化合物确认和分析方法筛选

表 1. 分析运行的色谱条件，HA/HFIP 法

使用 HPLC/MS 方法（HA /HFIP，二乙胺/六氟异丙醇，见表 1）分析样品（见图 3）。

图 3. 使用 HA/HFIP 和优化的梯度分离样品

根据分析结果提取质谱图，确定寡核苷酸分子量 10704Da。利用 OpenLab ChemStation 中的解卷积工具计算分子量，将信号与电荷数关联（图 4）。在制备时多电荷离子可用来触发馏分收集。

图 4. 通过解卷积计算寡核苷酸分子量和多电荷离子（A：电荷数）

考虑到制备在高流速运行下的溶剂成本，开发了一个不需要用到 HFIP 这类价格较高溶剂的方法（DBA-TRIS，二丁胺-TRIS），见表 2。

表 2. 分析和制备运行的色谱条件, DBA-TRIS 法

用 DBA/TRIS 分离的分析图谱见图 5。

图 5. 使用 DBA/TRIS 和通用梯度分离寡核苷酸

2、将分析数据导入到自动纯化软件中，指定目标化合物，自动生成制备聚焦梯度

将分析数据导入自动纯化软件中，点击设定目标峰，自动纯化软件就能自动生成制备聚焦梯度，见图 6。

图 6. 为寡核苷酸计算制备聚焦梯度

3、在制备柱上进行纯化

定义触发馏分收集的目标质量数，用聚焦梯度进行纯化。图 7 显示了制备分离和馏分收集的情况，共收集了八个馏分片段。

图 7. 使用 DBA/TRIS 和聚焦梯度对寡核苷酸进行制备纯化

4、通过自动纯化软件馏分导出工具，将需要分析的馏分生成序列表进行分析

图 8. 寡核苷酸纯化收集的八个馏分分析的色谱图叠加

馏分再分析的结果见图 8。第 一个馏分（蓝色标记）含杂质，其余所有馏分纯度均 >99%。质谱触发的选择性收集，使得馏分纯度更高。